李思琪，程嘉奇，何先林，李龍嬌，薛小腧

(1.重慶三峽職業(yè)學(xué)院，動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 404155； 2.重慶幼兒師范高等?？茖W(xué)校，重慶 404047)

螨病在西南地區(qū)是動(dòng)物體表高發(fā)寄生蟲病，據(jù)報(bào)道，西南地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)螨病的感染率高達(dá)60%以上[1]。螨病的感染將導(dǎo)致動(dòng)物體表大面積脫毛，皮膚瘙癢，動(dòng)物表現(xiàn)劇烈不安，食欲不振，會(huì)在各處進(jìn)行摩擦，導(dǎo)致皮膚損傷。從而對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖造成極大危害以及養(yǎng)殖戶的養(yǎng)殖成本帶來影響。傳統(tǒng)治療藥物多為化學(xué)治療藥，長(zhǎng)期使用過程中，能導(dǎo)致蓄積中毒，并且引發(fā)動(dòng)物產(chǎn)品安全性問題，從而迫切需要新藥品的研發(fā)，降低西南地區(qū)螨病的感染率[2]。

在中醫(yī)上，螨蟲病被稱為疥癬、疥瘡，是一種人與動(dòng)物常見皮膚病。中醫(yī)認(rèn)為疥癬的感染雖在體表，但與內(nèi)在臟腑、氣血有密切關(guān)系。若臟腑功能失調(diào)，經(jīng)絡(luò)不利，氣血壅滯，濕、熱、蟲三邪乘機(jī)侵入，就會(huì)引起局部病變[3]。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提出風(fēng)為百病之長(zhǎng)，皮膚為人體防御外界的第一道屏障。故風(fēng)邪是皮膚病感染的第一個(gè)致病因素?！端貑枴り庩?yáng)應(yīng)象大論》中明確指出了出汗后，毛孔打開、腠理疏松、濕邪侵襲肌膚所致容易引起皮肉經(jīng)脈疾病，所以濕邪也是導(dǎo)致疥癬發(fā)生的一個(gè)重要因素[4]。除此以外，肺火和心燥，導(dǎo)致氣血津液?jiǎn)适?，也?huì)引起皮膚病問題。而螨蟲病因?yàn)轲W，動(dòng)物常不停撓擦，皮膚會(huì)有潰爛，結(jié)痂，甚至皮膚出血，壞死等病理現(xiàn)象出現(xiàn)，故也需修復(fù)皮膚屏障。因此，在選用驅(qū)螨中藥中，主要以殺蟲抑菌、祛風(fēng)、潤(rùn)燥除濕、清熱解毒、活血生肌、潤(rùn)滑皮膚作為中藥篩選理論。

考慮到規(guī)?；B(yǎng)殖動(dòng)物數(shù)目眾多，外敷法方便實(shí)施，能節(jié)約人力成本，并且制備工藝條件較為簡(jiǎn)單，便于推廣。因此，在選用制備方法時(shí)，主要以軟膏劑作為制備劑型。本試驗(yàn)中以苦參、百部、大風(fēng)子、蛇床子、老鸛草、羊毛脂、凡士林等為主要處方，并進(jìn)行軟膏劑型的開發(fā)，以研制出一種易于涂抹、透氣性好、療效確切、性質(zhì)穩(wěn)定的中藥軟膏劑型。同時(shí)，根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2015版)關(guān)于軟膏制劑的質(zhì)量要求，對(duì)癬螨靈軟膏劑的制劑工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、制劑穩(wěn)定性等進(jìn)行了科學(xué)研究，為臨床動(dòng)物螨病防治提供新型安全有效藥物治療奠定了試驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑 苦參、百部、大風(fēng)子、蛇床子、老鹮草均購(gòu)自北京同仁堂藥業(yè)公司；硬脂酸、單甘脂、凡士林、羊毛脂、液狀石蠟、氮酮、甘油、三乙醇胺、尼鉑金乙酯、丁二醇均購(gòu)自山東優(yōu)索化工科技有限公司；無水乙醇購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康兔只16只，雌雄各半，體重(2.5±0.2)Kg；豚鼠6只，雌雄各半，體重(250±30)g，均由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 磁力攪拌器購(gòu)自上海醫(yī)械機(jī)廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自北京萊博泰儀器股份有限公司；純水儀購(gòu)自華創(chuàng)有限公司；電子恒溫水浴鍋購(gòu)自力辰科技有限公司；電子天平購(gòu)自上海蒲春有限公司。

2 制備方法

2.1 中藥組方比例 前期通過正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，在中藥組方比例為大風(fēng)子：百部：苦參：蛇床子：老鹮草1∶1∶1∶1∶1(低比例組)，1∶2∶2∶2∶2(中比例組)，1∶2∶2∶3∶3(高比例組)時(shí)，藥物浸膏得出率最高，成分析出值最大，且無毒性。通過將三組比例在臨床感染疥螨兔上分組治療比較，發(fā)現(xiàn)按照大風(fēng)子10份，苦參、百部20份，蛇床子、老鹮草30份的組方，臨床療效最佳，皮膚愈合快，具有較高安全性。具體數(shù)據(jù)見下表1。

表1 復(fù)方制劑不同比例對(duì)兔疥螨病臨床治療效果對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Comparative test results of different ratios of compound preparations in the clinical treatment of rabbit scabies

2.2 中藥浸膏制備 將五種中藥按照組方稱取，分別打成粉，過40目篩，將苦參、百部、老鹮草浸泡于蒸餾水中4 h，而大風(fēng)子、蛇床子具有揮發(fā)油成分，浸泡于乙醇中更利于成分析出，分別浸泡于65 %乙醇中4 h。按1∶1比例分別稀釋煎煮3次，每次1 h，過濾，合并濾液，用1倍量無水乙醇，水提醇沉，靜置過夜。待分層后，取其上清液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，85 ℃濃縮至半流體稠膏(50%)，然后將半流體稠膏置于80 ℃水浴鍋中加熱至稠膏。稠膏性狀以玻棒取濃縮藥液滴于干燥牛皮紙上，滴膏呈現(xiàn)珠狀，不擴(kuò)散。測(cè)定相對(duì)密度為1.2～1.3 g/mL。具體中藥浸膏制備方法見圖1。

圖1 中藥成分提取流程圖Fig 1 Flowchart of extracting traditional Chinese medicine ingredients

2.3 中藥軟膏劑基質(zhì)制備 制備中藥浸膏成分分析，油類成分較重，故癬螨靈軟膏采用O/W劑型作為基質(zhì)。按文獻(xiàn)方法[5]稱取硬脂酸120 g、單甘脂35 g、凡士林25 g、羊毛脂60 g、液狀石蠟60 g、水溶性氮酮20 mL(2%)、甘油35 g作為油相，三乙醇胺4 g、尼鉑金乙酯1 g、丁二醇70 mL(7%)，1000 mL蒸餾水作為水相。將油相成分混合置于容器內(nèi)，水浴加熱至完全融化，并于水浴鍋70 ℃內(nèi)保溫；將三乙醇胺、尼鉑金乙酯、丁二醇加入蒸餾水中，加熱至完全溶解。將水相緩慢倒入油相中、用磁力攪拌器攪拌均勻直至冷凝，置于冰箱5 ℃冷藏備用。

2.4 中藥軟膏劑處方 稱取中藥浸膏25.0 g，軟膏劑基質(zhì)100 g作為軟膏比例。將軟膏劑基質(zhì)取出，80 ℃水浴融化，攪拌均勻后加入中藥浸膏，邊加邊玻棒攪拌，至乳化完全，放置常溫凝固即得。

3 質(zhì)量檢測(cè)評(píng)價(jià)

3.1 穩(wěn)定性檢查

3.1.1 離心試驗(yàn) 將中藥軟膏劑放入離心管中，3000 r/min離心30 min后，取出觀察有無分層及破乳現(xiàn)象。

3.1.2 耐寒試驗(yàn) 將中藥軟膏劑置于離心管內(nèi)，置于-20 ℃冰箱24 h后，觀察有無分層破乳以及色澤、均勻性改變等現(xiàn)象。

3.1.3 耐熱試驗(yàn) 將中藥軟膏劑置于離心管內(nèi)，置于50 ℃恒溫箱6 h，觀察有無分層破乳、霉敗以及色澤、均勻性改變等現(xiàn)象。

3.1.4 加速試驗(yàn) 將中藥軟膏劑裝入器皿內(nèi)，置于溫度(45±2)℃、相對(duì)濕度為75%的恒溫培養(yǎng)箱中，連續(xù)放置3個(gè)月，定期考察、觀察有無分層破乳、霉敗以及色澤、均勻性改變等現(xiàn)象。

3.1.5 pH值檢查 抽取中藥軟膏劑，用pH酸度計(jì)測(cè)定酸堿值。

3.1.6 粒度檢查 將軟膏劑在玻片上涂抹薄片，置于顯微鏡下觀察。

3.2 中藥軟膏劑安全性研究 取體重(2.5±0.2)Kg白色健康家兔16只，雌雄各半，分為空白對(duì)照組1、空白對(duì)照組2、完整皮膚給藥組、破損皮膚給藥組。每組家兔耳部及頸部舔不到區(qū)域除毛，空白對(duì)照組2和破損皮膚組家兔在除毛區(qū)域用一次性刀片鈍性刮破表皮組織，直至輕微滲血為止。每組家兔脫毛區(qū)均勻涂抹中藥軟膏劑，每天涂藥2次，每次涂抹1 g?？瞻讓?duì)照組1和2涂生理鹽水2 mL作為陰性對(duì)照，并分籠飼養(yǎng)，連續(xù)用藥7 d，并在除去藥物后48 h內(nèi)觀察皮膚有無紅斑和水腫現(xiàn)象，按照表2進(jìn)行強(qiáng)度刺激、過敏和毒副反應(yīng)評(píng)價(jià)[6]。

表2 皮膚刺激及毒副反應(yīng)評(píng)價(jià)表Tab 2 Evaluation of skin irritation and side effects

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)開始及結(jié)束24 h內(nèi)，1周后分別稱取每組家兔體重，分析不同組增重情況，主要公式如下：a.平均日增重(g)=(實(shí)驗(yàn)?zāi)┢骄w重-實(shí)驗(yàn)初平均體重)/實(shí)驗(yàn)天數(shù)。

4 結(jié)果與分析

4.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 由表3和圖2可知，本品外觀性狀為淺棕色，質(zhì)地細(xì)膩，手感良好，易于推開和涂抹，穩(wěn)定性良好，鏡檢下未見大顆粒存在。基本符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2015版)有關(guān)軟膏項(xiàng)的要求。

表3 軟膏劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析表Tab 3 Ointment quality standard analysis

圖2 癬螨靈軟膏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig 2 Test results of the stability of Xian Manling ointment

4.2 動(dòng)物安全性試驗(yàn)結(jié)果 刺激性試驗(yàn)結(jié)果：完整皮膚給藥組受試兔未見充血和水腫，破損皮膚給藥組受試兔皮膚未出現(xiàn)水腫，僅表現(xiàn)出輕微紅斑，紅斑在6 h內(nèi)均消褪。

毒副作用結(jié)果：在試驗(yàn)1周內(nèi)，受試兔精神良好，采食、尿液及糞便均正常，未見中毒或異常癥狀。

日增重結(jié)果：用藥1周內(nèi)，四組家兔體重變化均不顯著(P>0.05)，且停藥一周后，每組家兔體重沒有下降。

5 討論與結(jié)論

螨病通過接觸傳播，常引起畜禽大批量發(fā)病，甚至引起大面積死亡，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展。目前螨病的疫苗仍處于研究階段，藥物防治螨病仍是主要方式[7]?；瘜W(xué)類藥物如有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類藥物有一定治療效果，但這些藥物本身對(duì)動(dòng)物有較大毒性。而抗生素類藥物如伊維菌素、多拉菌素等，化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)，很難被分解，長(zhǎng)時(shí)間殘留在畜產(chǎn)品中，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物及消費(fèi)者食物中毒[8]。因此篩選具有殺螨活性的天然藥物，并進(jìn)一步制成外用制劑，表現(xiàn)出較高研究?jī)r(jià)值。

本軟膏劑組方經(jīng)過前期篩選[9]和離體驅(qū)螨實(shí)驗(yàn)觀察[10]，所萃取的大風(fēng)子液、苦參液、百部液、蛇床子液及混合液對(duì)離體螨蟲均有一定殺滅作用，表明該制劑組方切實(shí)可行。在此基礎(chǔ)上，加入活血為主的老鹮草，具有活血生肌及促進(jìn)創(chuàng)面早日愈合功效，通過前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定藥物組成比例，所組結(jié)果表明，該中藥混合液的臨床療效治愈率高，皮膚損傷愈合良好，確有臨床療效，但治愈率仍然未達(dá)到80%以上，且治愈所需時(shí)間較長(zhǎng)，仍需進(jìn)一步優(yōu)化制備工藝以提升臨床療效。

鑒于在臨床生產(chǎn)中使用噴劑耗費(fèi)時(shí)間較多，且每日需用藥3～5次，不利于在規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖生產(chǎn)中使用，本研究利用羊毛脂和凡士林制作軟膏劑，具有潤(rùn)澤保濕作用，減少創(chuàng)面刺激和維持創(chuàng)面安靜，有利于創(chuàng)面愈合。本試驗(yàn)中軟膏劑由中藥萃取液和適當(dāng)基質(zhì)混合而成?；|(zhì)為軟膏的賦形劑，對(duì)軟膏的質(zhì)量和療效發(fā)揮都具有重要影響[11]。軟膏基質(zhì)分為水溶性，油脂性和乳劑型基質(zhì)[12]。本研究根據(jù)癬螨靈的主要藥物成分及適應(yīng)證以及根據(jù)前期基質(zhì)篩選，最終選擇乳劑中O/W劑型作為選擇基質(zhì)。

中藥制劑雖有相對(duì)安全性，但中藥成分十分復(fù)雜，部分成分可能引發(fā)過敏或毒副作用[13]。而軟膏劑作為外用制劑，臨床用藥前毒理學(xué)評(píng)價(jià)主要考察其對(duì)皮膚刺激性[14]。但癬螨靈主要針對(duì)螨蟲病例，螨蟲感染臨床典型病變就是皮膚破潰，結(jié)痂。因此，本試驗(yàn)中考慮到軟膏劑涂敷皮膚破潰處，是否會(huì)從皮膚破潰處大量進(jìn)入血液出現(xiàn)全身毒副作用，故通過構(gòu)建家兔的皮膚破損模型,確定了各試驗(yàn)組家兔體重變化組間對(duì)比不顯著，全身癥狀無異常，未出現(xiàn)毒性反應(yīng)；同時(shí)，皮膚測(cè)試結(jié)果，只有破損皮膚組有輕微刺激表現(xiàn)，但在6 h內(nèi)消退完全，與文獻(xiàn)報(bào)告破損皮膚使用外用制劑的輕微刺激表現(xiàn)相一致[15]。由此可知，癬螨靈軟膏劑具有較好的穩(wěn)定性，良好的安全性，無明顯毒副反應(yīng)，具有深入研發(fā)前景。