張小龍，沈佳晨，聶 貞，王美紅，蔣 玥，卜仕金*

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化和集約化的迅速發(fā)展，豬球蟲病的危害也日益凸顯，給養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟損失。目前藥物治療仍然是防治豬球蟲病的主要手段。帕托珠利(ponazuril)又名妥曲珠利砜，是妥曲珠利的主要活性代謝產(chǎn)物，其口服糊劑(商品名Marquis?)已批準用于治療馬原生動物性腦脊髓炎(EPM)，已有研究顯示帕托珠利對畜禽球蟲病可能也有良好的防治效果[1-2]。與妥曲珠利相比，帕托珠利易于通過血腦屏障[3]。目前帕托珠利在山羊[4]、美洲駝[5]、牛[6]和馬[3]等實驗動物體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究報道較多，但在豬及其他食品動物的藥物動力學(xué)研究國內(nèi)報道甚少。前期臨床有效性試驗結(jié)果表明，湖北龍翔藥業(yè)科技股份有限公司研制了5%帕托珠利混懸液，按15～20 mg/kg bw單劑量，置于3～5日齡仔豬舌根處，可有效防治人工感染的仔豬球蟲病。本試驗對5%帕托珠利混懸液在豬體內(nèi)的藥動學(xué)特征及口服生物利用度進行了研究，以期為帕托珠利混懸液的臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 帕托珠利標準品：含量99.6%，批號180502 WS；帕托珠利混懸口服液：含量5%，規(guī)格100 mL，生產(chǎn)批號為20180501；帕托珠利注射液：含量6%，規(guī)格100 mL，生產(chǎn)批號為19092301，僅用于本試驗開展生物利用度研究；生產(chǎn)商均為湖北龍翔藥業(yè)科技股份有限公司。甲醇、乙腈為色譜級，購自美國TEDIA公司；乙酸，色譜純，購自德國CNW公司；乙酸乙酯，分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與耗材 高效液相色譜儀(配備紫外檢測器)Agilent 1260，安捷倫公司；電子分析天平(感量0.0001 g)，德國賽多麗絲天平公司；超聲儀，KS-250D，寧波科生儀器廠；超純水儀，UPH-11-20T，成都超純科技有限公司；氮吹儀，N-EVAP-12，Organomation Associates 公司；臺式高速冷凍離心機，Centrifuge 5810R，Eppendorf公司；微型渦旋混合儀，WH-1，上海滬西分析儀器有限公司。色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，安捷倫公司；離心管，2 mL、5 mL，美國 Axygen 公司；微量移液器，10 μL、200 μL、1000 μL，Eppendorf公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 流動相 將乙腈與0.2%乙酸水溶液按53∶47(V/V)比例混勻，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾后，超聲脫氣40 min即可，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 帕托珠利標準液和工作液 帕托珠利標準儲備液：準確稱取約10.0 mg帕托珠利標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即配制成濃度為1 mg/mL的標準儲備液，與-20 ℃冰箱中保存。帕托珠利工作液：準確吸取適量帕托珠利標準儲備液，用流動相稀釋制備濃度為1、5、10、20、50、100 μg/mL的標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 帕托珠利空白血漿添加樣品 準確吸取180 μL空白豬血漿，加入20 μL帕托珠利工作液，渦旋混勻0.5 min，即可制得帕托珠利空白血漿添加樣品。

1.4 試驗動物 20頭40日齡的健康杜梅二元雜交黑豬(公母各半)，購自江蘇鹽城市大豐區(qū)中北畜牧場，平均體重約11.73±1.83 kg。試驗前經(jīng)一周的適應(yīng)期后從中選擇8頭臨床健康的母豬和8頭臨床健康的公豬用于實驗。試驗前采用耳標標記，母豬編號為1～8號，公豬編號為9～16號。試驗前1 d檢查確認處于良好的健康狀態(tài)。試驗期間常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水和進食，飼料均為不添加任何藥物的全價飼料。

1.5 方法

1.5.1 試驗設(shè)計與給藥方案 采用平行試驗設(shè)計。16頭健康杜梅二元雜交仔豬隨機分為兩組，每組8頭，公母各半。所有動物給藥前禁食12 h，給藥后2 h恢復(fù)正常飲食?？诜o藥組，置舌根部給藥，單劑量15 mg/kg bw；靜脈給藥組，經(jīng)耳緣靜脈給藥，單劑量6 mg/kg bw。具體分組與給藥方案見表1。

表1 試驗分組與給藥方案Tab 1 The experiment design and the dosage regimen

1.5.2 血樣采集與保存 豬采用仰臥保定后經(jīng)前腔靜脈采血。所有動物給藥前均采集一次空白血，記為0 min?？诜o藥組，分別在給藥后30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、8 d、12 d、16 d、21 d、26 d、31 d進行采血；靜脈給藥組，分別在給藥后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、8 d、12 d、16 d、21 d、26 d、31 d進行采血。每次采血量為3 mL，采用肝素抗凝。全血經(jīng)5000 r/min離心10 min后吸取上層血漿與2 mL離心管中，-20 ℃冷凍保存。以給藥時刻記為0時刻，采血點均以0時刻為基準，前4 h內(nèi)采血點理論偏差應(yīng)在±2 min 以內(nèi)，4 h后采血點理論偏差應(yīng)在±5 min以內(nèi)。

1.5.3 血漿中帕托珠利含量的測定 豬血漿中帕托珠利含量的測定采用經(jīng)驗證的HPLC法測定。準確吸取豬血漿樣品200 μL于2 mL離心管中，加入乙酸乙酯1 mL渦旋振蕩3 min，12000 r/min離心10 min，將上清液移至5 mL離心管中，下層殘渣用乙酸乙酯0.5 mL重復(fù)提取一次，合并上清液。上清液經(jīng)氮吹儀或離心濃縮儀(40 ℃)吹干，流動相復(fù)溶，渦旋振蕩3 min，12000 r/min離心10 min，取上清經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，濾液供HPLC分析。

色譜條件：色譜柱 安捷倫 ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈與0.2%乙酸水(53∶47，V/V);流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL;紫外檢測波長：250 nm。

將豬血漿樣品按上述的血漿預(yù)處理方法處理后，再按上述的色譜條件進行分析，測出待測物的峰面積，以外標法定量，代入當日隨行的標準曲線，計算出豬血漿中帕托珠利的含量。

同一頭豬的血漿樣品在同一分析批內(nèi)完成，每個分析批的質(zhì)控樣品數(shù)為樣品總數(shù)的5%，不少于3個質(zhì)控樣品(0.2、5、7.5 μg/mL 3個添加濃度水平)，質(zhì)控樣品的偏差應(yīng)小于15%。

1.5.4 數(shù)據(jù)分析 將實測后的各動物血藥濃度-時間數(shù)據(jù)按對應(yīng)的格式整理后，采用Winnonlin5.2軟件計算藥動學(xué)參數(shù)，得出每個動物單獨的以及每組動物平均的藥動學(xué)參數(shù)并進行數(shù)據(jù)的分析比較。采用Graphad prism8.0繪制帕托珠利在豬血漿中的藥時曲線。絕對生物利用度的計算公式如下：

式中：F為生物利用度；AUCpo為口服藥時曲線下面積；AUCiv為靜注藥時曲線下面積；Div為靜注給藥劑量；Dpo為口服給藥劑量。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬血漿中帕托珠利含量測定的HPLC方法學(xué)驗證 空白血漿、帕托珠利標準品、空白血漿添加帕托珠利標準品HPLC色譜圖見圖1，在本課題組已建立的HPLC檢測條件下,血漿樣品中帕托珠利的出峰時間約8.9 min，峰形良好，主峰與雜質(zhì)峰完全分離。在0.10～10.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2≥0.999)。方法的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)分別為0.04 μg/mL和0.1 μg/mL，回收率均大于90%，批內(nèi)和批間的精密度RSD分別小于5%和9%。

A：空白血漿; B: 0.1 μg/mL帕托珠利標準品; C:空白血漿添加帕托珠利標準品A：Blank plasma; B: Ponazuril standard at 0.1 μg/mL; C: Spiked plasma sample at the level of 0.1 μg/mL圖1 HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 給藥后豬血漿中帕托珠利色譜圖 給藥后豬血漿中帕托珠利的實測色譜圖見圖2。

D: 5號豬口服給藥4 d后; E: 14號豬靜注給藥5 min后D: 4 days in pig No 5 after oral administration; E: 5 minutes in pig No 14 after intravenous injection圖2 給藥后帕托珠利色譜圖Fig 2 Chromatogram of ponazuril after administration

2.3 血藥濃度與藥動學(xué)參數(shù) 豬按6 mg/kg bw單劑量靜注帕托珠利注射液后，豬血漿中帕托珠利的平均藥時曲線見圖3，藥動學(xué)參數(shù)見表2。由表可知，靜注給藥后帕托珠利在仔豬體內(nèi)的主要藥動學(xué)參數(shù)如下：平均消除半衰期(T1/2β)為136.98 h，平均滯留時間(MRT)為165.92 h，平均藥時曲線下面積(AUC0-t)為1570.97 h·μg/mL，平均表觀分布容積(Vz)為695.59 mL/kg，平均血漿清除率(CL)為3.77 mL/(h·kg)。

豬按15 mg/kg bw單劑量口服帕托珠利混懸液后，豬血漿中帕托珠利的平均藥時曲線見圖3，藥動學(xué)參數(shù)見表2。由表可知，單劑量口服帕托珠利混懸液后帕托珠利在仔豬體內(nèi)主要藥動學(xué)參數(shù)如下：平均T1/2β為134.05 h，平均Tmax為42.00 h，平均Cmax為14.03 μg/mL，平均MRT為173.19 h，平均AUC0-t為2831.00 h·μg/mL，帕托珠利混懸液口服給藥絕對生物利用度為72.08%。

圖3 豬單劑量靜注和單劑量口服后血漿中帕托珠利的平均藥時曲線Fig 3 The plasma concentration-time curve of ponazuril after intravenous injection and oral administration

表2 單劑量靜注帕托珠利注射液和口服帕托珠利混懸液后的藥動學(xué)參數(shù)Tab 2 The pharmacokinetics parameters of ponazuril in plasma of piglet after intravenous injection and oral

3 討論與結(jié)論

3.1 帕托珠利血藥濃度測定方法 據(jù)報道，目前帕托珠利血藥濃度測定法主要有高效液相色譜法(HPLC)[7]、高效液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[8-9]等。本試驗參考相關(guān)文獻資料建立了HPLC外標法測定豬血漿中帕托珠利含量的測定方法。血漿中帕托珠利采用乙酸乙酯萃取藥物，置于40 ℃離心濃縮儀吹干，縮短了樣品處理時間，不僅操作方便，而且回收率高且雜質(zhì)峰少。以乙腈-0.2%乙酸水為流動相，待測物帕托珠利出峰時間穩(wěn)定，峰形尖銳，與血漿中其余雜質(zhì)完全分離。在上述血漿樣品處理方法和色譜檢測條件下，血漿中帕托珠利的回收率在90%以上，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于9%，能滿足色譜法測定豬血漿中帕托珠利的相關(guān)要求，表明本試驗建立的血藥濃度檢測方法可用于帕托珠利混懸液在豬體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究。

3.2 豬單劑量靜注帕托珠利注射劑后的藥動學(xué)特征 豬單劑量靜注(6 mg/kg bw)帕托珠利注射液后，帕托珠利的平均T1/2β為136.98 h，平均MRT為165.92 h，平均CL為3.77 mL/(h·kg)，表明帕托珠利在豬體內(nèi)消除速度緩慢。帕托珠利消除半衰期較長在雞上也有報道[10]，通過單劑量5 mg/kg bw給藥，結(jié)果顯示帕托珠利在雞體內(nèi)的消除半衰期為50.32 h，平均滯留時間為72.63 h，體清除率為0.13 mL/h，這可能與均三嗪這類藥物的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。帕托珠利平均Vz為695.59 mL/kg，表明帕托珠利在豬體內(nèi)分布較窄，這可能與進入豬體內(nèi)后可能主要分布在血漿中有關(guān)[11]。Dirikolu L等[3]研究表明，給馬靜注帕托珠利(1 mg/kg bw)后，平均T1/2β為128.99 h，Vz為313.4 mL/kg，這表明在馬體內(nèi)消除同樣緩慢，且分布較差，在體內(nèi)能保持較長時間。Wesolowski CA等[12]研究表明，通過靜注途徑給藥之后，藥物在體內(nèi)會存在血管階段和稀釋階段。在血管階段藥物以較短的時間進入血漿中，而在稀釋階段，藥物會以較長的時間進入到其他組織中去。

3.3 豬單劑量口服帕托珠利混懸液后的藥動學(xué)特征 豬單劑量口服(15 mg/kg bw)帕托珠利混懸液后，帕托珠利的平均T1/2β為134.05 h，與靜注組給藥的半衰期(136.98 h)相近，與Zou M等[13]研究的豬單劑量(5 mg/kg bw)口服帕托珠利的T1/2β135.28 h基本一致，表明帕托珠利在豬體內(nèi)消除緩慢，且遠比其前體藥物妥曲珠利在豬體內(nèi)消除慢[14]。這或許與帕托珠利更慢的組織清除率有關(guān)[7]。單劑量口服帕托珠利溶液在不同動物體內(nèi)的消除半衰期也不同，如山羊[4](10 mg/kg bw)為129.00 h，美洲駝[5](20 mg/kg bw)為84.00 h、馬[3](2.2 mg/kg bw)為81.24 h、牛[6](5 mg/kg bw)為58.00 h。盡管帕托珠利消除存在一定的種屬差異性，但均顯示其進入動物體內(nèi)后消除緩慢。豬口服帕托珠利后的平均Tmax為42.00 h，平均Cmax為14.03 μg/mL，這表明豬口服帕托珠利混懸液吸收緩慢，達峰時間較長，提示帕托珠利在體內(nèi)可能存在肝腸循環(huán)現(xiàn)象。帕托珠利混懸液單劑量口服后平均AUC0-t為2831.00 h·μg/mL，絕對生物利用度F為72.08%，表明帕托珠利混懸液口服給藥吸收程度良好。另據(jù)Dirikolu L等[3]研究表明，不同溶劑對帕托珠利的生物利用度影響很大，加入DMSO后在馬體內(nèi)的絕對生物利用度可達71%，是用水灌服的3倍。生物利用度研究結(jié)果表明，仔豬口服帕托珠利混懸液后能維持較久的血藥濃度，這對臨床預(yù)防哺乳期仔豬的球蟲病或許有益。

在前期臨床有效性試驗確定推薦劑量的基礎(chǔ)上，首次評價了帕托珠利混懸液在靶動物體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)特征，為其臨床中新獸藥注冊、研發(fā)和安全性評價以及臨床合理應(yīng)用提供了依據(jù)。湖北龍翔藥業(yè)科技股份有限公司研制的2.5%帕托珠利混懸液單劑量置舌根部給藥后，帕托珠利在豬體內(nèi)具有分布較差、消除緩慢、達峰時間較長但吸收良好的藥動學(xué)特征，按臨床推薦劑量15～20 mg/kg bw，可用于臨床上預(yù)防仔豬球蟲病的暴發(fā)。