宋婷婷，劉 靜，瞿紅穎，賈 興，耿智霞，郭李珉，劉 欣*，魏占勇，曹興元

(1.河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司/河北省獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心，石家莊 050041；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193)

泰地羅新(Tildipirosin)是一種新型十六元環(huán)動(dòng)物專用的大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗生素，由英特威公司開發(fā)，而后被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)在美國上市銷售[1]。它是泰樂菌素的衍生物，具有高效、廣譜的抗菌活性，對(duì)胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌和副豬嗜血桿菌引起的豬呼吸道疾病及溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌引起的牛呼吸道疾病具有很好的療效[2-4]。大環(huán)內(nèi)酯類藥物通過與原核生物的核糖體蛋白50S亞基結(jié)合從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成而發(fā)揮抗菌作用。一般而言，大環(huán)內(nèi)酯類藥物不會(huì)與哺乳動(dòng)物的核糖體結(jié)合，是一類相對(duì)較安全的獸用藥物[5]。

國外多年的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用表明，泰地羅新注射液在動(dòng)物呼吸感染性疾病防治中具有廣闊的應(yīng)用前景[6-7]。本試驗(yàn)對(duì)泰地羅新注射液肌內(nèi)注射和靜脈注射給藥后在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征及絕對(duì)生物利用度進(jìn)行了研究，旨在為獸醫(yī)臨床安全使用該藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Acquity UPLC-TQD，美國Waters公司；TGL-15B型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海安亭公司；HMA-50A 渦旋混合器：天津恒奧公司。電子分析天平：MS105DU型，感量0.00001 g，Mettler Toledo；天平：JY5002 型，感量0.01 g，舜宇恒平。

1.2 藥品與試劑 泰地羅新對(duì)照品：含量98.7%，河北遠(yuǎn)征禾木藥業(yè)有限公司提供；泰地羅新-D10對(duì)照品：含量98.9%，購買自加拿大TRC公司；泰地羅新注射液：50 mL∶2 g，50 mL/瓶，河北遠(yuǎn)征禾木藥業(yè)有限公司提供；乙腈、甲酸，均為色譜純；由Milli-Q超純水儀制取的超純水，符合GB/T 6682一級(jí)用水規(guī)定。

1.3 試液的配制

1.3.1 泰地羅新標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mg/mL) 精密稱取適量泰地羅新對(duì)照品，用甲醇溶解并稀釋制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置-20 ℃冰箱中保存。

1.3.2 泰地羅新標(biāo)準(zhǔn)工作液(10 μg/mL) 準(zhǔn)確量取適量泰地羅新標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇溶解并稀釋制成濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，置-20 ℃冰箱中保存。

1.3.3 泰地羅新-D10(內(nèi)標(biāo))標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 精密稱取適量泰地羅新-D10對(duì)照品，用甲醇溶解并稀釋制成濃度為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置-20 ℃冰箱中保存。

1.3.4 泰地羅新-D10(內(nèi)標(biāo))標(biāo)準(zhǔn)工作液 準(zhǔn)確量取適量泰地羅新-D10標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇溶解并稀釋制成濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置-20 ℃冰箱中保存。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 16頭健康狀況良好的三元雜交豬，雌雄各半，3～4月齡，由北京畜牧總站試驗(yàn)豬場(chǎng)提供，入選時(shí)體重為20.0～25.0 kg。所有試驗(yàn)動(dòng)物均被飼養(yǎng)在專用豬籠中，通過籠號(hào)進(jìn)行標(biāo)識(shí)，在入選當(dāng)天被隨機(jī)分配1～16的編號(hào)，其環(huán)境條件適宜豬的生活。按常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水和采食，每天定量給予顆粒飼料。試驗(yàn)前觀察1周，動(dòng)物飲食、行為和體溫等臨床表現(xiàn)正常，有異常的動(dòng)物，應(yīng)剔除試驗(yàn)。

1.5 方法

1.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)方案 16頭受試豬隨機(jī)分成 A、B兩組，每組8頭，A 組動(dòng)物的平均體重為23.64±4.85 kg，B 組動(dòng)物的平均體重為24.09±4.99 kg。A組為肌內(nèi)注射組，按照推薦劑量4 mg/kg BW給藥，B組為靜脈注射組，按照1/4推薦劑量1 mg/kg BW給藥。根據(jù)給藥前一天的體重稱量結(jié)果計(jì)算受試制劑的給藥量。

1.5.2 樣品采集 在每個(gè)給藥方式的不同時(shí)間點(diǎn)，從豬的前腔靜脈叢采血5 mL置于一次性肝素鈉真空采血管中。采血時(shí)間點(diǎn)如下：對(duì)于肌內(nèi)注射給藥組和靜脈注射給藥組，均于給藥前及給藥后0.083 h、0.167 h、0.333 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h 采集血樣，離心，分離血漿后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 色譜條件 色譜柱：BEH C18柱(50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)；梯度洗脫；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸乙腈溶液，B相為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

1.5.4 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜儀：Waters XEVO TQD；離子源(ESI)：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；脫溶劑氣流速：800 L/h；Q1、Q3均為單位分辨率。泰地羅新及泰地羅新-D10MRM質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表2。

表2 泰地羅新和泰地羅新-D10質(zhì)譜條件Tab 2 Mass spectrometry of tildipirosin and tildipirosin-D10

1.5.5 血漿樣品的處理 從冰箱中取出豬血漿，常溫解凍，搖勻后精密移取0.5 mL血漿，加入25 μL泰地羅新-D10內(nèi)標(biāo)工作液(1 μg/mL)，渦動(dòng)10 s。加入乙腈2 mL，渦動(dòng)2 min，使用高速冷凍離心機(jī)在4 ℃條件下以8000 r/min離心10 min，取出上清液。將以上提取液在50 ℃水浴下氮吹至近干。用初始流動(dòng)相 0.5 mL溶解殘余物，渦旋混合，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾，待UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.5.6 檢測(cè)限和定量限 在空白樣品中添加已知濃度的泰地羅新標(biāo)準(zhǔn)工作液，制成含泰地羅新不同濃度的加標(biāo)試樣進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)操作5次，以能達(dá)到信噪比S/N≥3時(shí)樣品的最低濃度為血漿中的檢測(cè)限(LOD)，以能達(dá)到信噪比S/N≥10時(shí)樣品的最低濃度為血漿中的定量限(LOQ)。

1.5.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 分別設(shè)置5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次為5、20、100、200、500 ng/mL(內(nèi)標(biāo)濃度為50 ng/mL)，依據(jù)設(shè)定濃度加入標(biāo)準(zhǔn)品，將所得泰地羅新峰面積與泰地羅新-D10峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的泰地羅新濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到相應(yīng)的曲線方程與相關(guān)系數(shù)。

1.5.8 準(zhǔn)確度與精密度 在500 μL空白血漿中加入泰地羅新標(biāo)準(zhǔn)工作液，制成含泰地羅新濃度為5、20、200 ng/mL的含藥血漿樣品。按照“1.5.5”項(xiàng)下的血漿樣品前處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析。每日3個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度重復(fù)6次，持續(xù)3 d，以樣品中藥物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，求得低、中、高3個(gè)濃度的回收率，計(jì)算各組變異系數(shù)，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度與精密度。

1.5.9 穩(wěn)定性 分別添加3個(gè)不同濃度5、20、200 ng/mL的泰地羅新標(biāo)準(zhǔn)品于血漿中混勻：對(duì)樣品進(jìn)行前處理檢測(cè)，室溫24 h后以同樣的方法再次制備樣品進(jìn)行前處理檢測(cè)，分析待測(cè)物在室溫的穩(wěn)定性；每個(gè)濃度分成3份，置-20 ℃冰箱中，反復(fù)凍融3次后，與新鮮制備的血漿樣品同時(shí)檢測(cè)，分析待測(cè)物在凍融過程中的穩(wěn)定性；樣品在進(jìn)行前處理后，分別在0、8 h檢測(cè)樣品，分析前處理后待測(cè)物的穩(wěn)定性；樣品在進(jìn)行前處理后，分別在0、21 d進(jìn)行前處理檢測(cè)，分析待測(cè)物在血漿中的穩(wěn)定性。

1.5.10 基質(zhì)效應(yīng) 用流動(dòng)相配制成濃度分別為低、高2個(gè)濃度(20、200 ng/mL)的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為基質(zhì)效應(yīng)考察的參照溶液，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。取不同來源的空白血漿樣品，按照“1.5.5”項(xiàng)下進(jìn)行樣品前處理，分別加入低、高2個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL溶解氮吹后的殘余物，渦旋混勻，過0.2 μm濾膜，作為空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式為：

ME%= A基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液/A參照溶液×100%

1.5.11 數(shù)據(jù)處理與分析 采用藥代動(dòng)力學(xué)軟件WinNonlin6.4處理藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)行非房室模型分析，求出各藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)T1/2﹑Tmax﹑Cmax﹑AUC0-t和AUC0-∞等，以血藥濃度平均值對(duì)時(shí)間作藥-時(shí)曲線圖，并根據(jù)公式計(jì)算絕對(duì)生物利用度(FIM)。

FIM=(DoseIV/DoseIM)×(AUClastIM/AUClastIV)

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 檢測(cè)限及定量限 經(jīng)測(cè)定，本方法檢測(cè)限(LOD)為2 ng/mL，定量限(LOQ)為5 ng/mL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 結(jié)果顯示，泰地羅新在5～500 ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性方程Y=3.69137X+0.858636，r≥0.999。

2.1.3 回收率與精密度 對(duì)添加不同濃度泰地羅新的血漿樣品重復(fù)測(cè)定6次，共3個(gè)批次，其測(cè)定結(jié)果及計(jì)算所得的回收率與精密度見表3。由表中數(shù)據(jù)可知：泰地羅新在5、20、200 ng/mL 3個(gè)添加濃度水平下的回收率均在82.00%～109.99%，回收率穩(wěn)定，批內(nèi)變異系數(shù)≤5%，批間變異系數(shù)≤10%，精密度良好。

表3 血漿中泰地羅新回收率和精密度考察試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 3 Recovery and precision test results of tildipirosin in plasma(n=6)

2.1.4 穩(wěn)定性 樣品室溫放置24 h后進(jìn)行前處理檢測(cè)，與新鮮制備的樣品相比，待測(cè)藥物的響應(yīng)值的變異系數(shù)均低于20%；樣品反復(fù)凍融3次后，待測(cè)藥物的響應(yīng)值的變異系數(shù)均低于20%；待測(cè)藥物在進(jìn)行前處理后，分別在0、8 h檢測(cè)樣品，待測(cè)藥物的響應(yīng)值的變異系數(shù)低于20%；待測(cè)藥物在進(jìn)行前處理后，分別在0、21 d時(shí)待測(cè)藥物的響應(yīng)值的變異系數(shù)低于20%。以上穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果均符合農(nóng)業(yè)部第1247號(hào)公告的相關(guān)規(guī)定。

2.1.5 基質(zhì)效應(yīng) 經(jīng)過試驗(yàn)測(cè)定，泰地羅新在血漿低、高2個(gè)濃度樣品中檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)在92.24%～100.58% 之間(RSD<3.12%)，故此分析方法的基質(zhì)效應(yīng)可以忽略不計(jì)。

2.2 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

2.2.1 血藥濃度-時(shí)間曲線 豬肌內(nèi)注射(4 mg/kg BW)和靜脈注射(1 mg/kg BW)泰地羅新注射液后，不同時(shí)間測(cè)得的泰地羅新注射液對(duì)應(yīng)的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖1。由圖1可知，泰地羅新在豬體內(nèi)吸收迅速，在1 h內(nèi)可達(dá)到最大血藥濃度；肌內(nèi)注射泰地羅新的Cmax﹑AUC要大于靜脈注射泰地羅新。

圖1 豬肌內(nèi)注射和靜脈注射泰地羅新注射液后的平均藥-時(shí)曲線圖Fig 1 The mean concentration-time curves after intramuscular injection and intravenous injection of Tildipirosin in pigs

2.2.2 主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 血藥濃度時(shí)間數(shù)據(jù)采用WinNonlin6.4 版藥代參數(shù)計(jì)算軟件進(jìn)行非房室模型分析計(jì)算藥動(dòng)學(xué)主要參數(shù)，見表4、表5。

表4 豬肌內(nèi)注射(4 mg/kg)泰地羅新注射液后泰地羅新的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=8)Tab 4 Summary of the mean plasma pharmacokinetic parameters in pigs administered intramuscular injection of Tildipirosin at the dose of 4 mg/kg body weight(n=8)

表5 豬靜脈注射(1 mg/kg)泰地羅新注射液后泰地羅新的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=8)Tab 5 Summary of the mean plasma pharmacokinetic parameters in pigs administered intravenous injection of Tildipirosin at the dose of 1 mg/kg body weight(n=8)

2.3 絕對(duì)生物利用度結(jié)果 按照“1.5.11”項(xiàng)下公式計(jì)算泰地羅新注射液的絕對(duì)生物利用度，結(jié)果顯示肌內(nèi)注射泰地羅新注射液的絕對(duì)生物利用度為77.15%。

3 討 論

3.1 方法學(xué) 本試驗(yàn)建立了豬血漿中泰地羅新UPLC-MS/MS檢測(cè)方法，該方法中樣品測(cè)定靈敏度與準(zhǔn)確度均較高，各項(xiàng)指標(biāo)都能夠滿足測(cè)定要求。本試驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行標(biāo)定，用泰地羅新-D10做內(nèi)標(biāo)物，能夠更好的對(duì)目標(biāo)物準(zhǔn)確定量，這與廖遠(yuǎn)軍[10]報(bào)道的用泰樂菌素做內(nèi)標(biāo)物不同。

3.2 泰地羅新藥動(dòng)學(xué)特征 泰地羅新注射液以4 mg/kg BW單劑量肌內(nèi)注射于豬后，測(cè)得0～144 h泰地羅新的Tmax、Cmax、AUClast、T1/2λz、MRTlast分別為0.58±0.36 h、0.88±0.17 μg/mL、11.00±4.05 μg·h/mL、33.58±22.01 h、35.60±10.00 h。國外文獻(xiàn)報(bào)道[8]，豬按4 mg/kg BW單劑量肌內(nèi)注射泰地羅新，Tmax為 23 min，Cmax為0.90 μg/mL，AUClast為11.01 μg·h/mL，與本研究結(jié)果基本一致。趙森等[9]等報(bào)道，藏香豬按4 mg/kg BW單劑量肌內(nèi)注射泰地羅新，Tmax為0.45 h，Cmax為0.75 μg/mL，T1/2為120.51 h，AUC為22.22 μg·h/mL。廖遠(yuǎn)軍[10]報(bào)道，豬按4 mg/kg BW單劑量肌內(nèi)注射泰地羅新，Tmax為0.38 h，Cmax為0.97 μg/mL，T1/2為124.45 h，AUC為15.75 μg·h/mL。閆超群[11]等報(bào)道，豬按4 mg/kg BW單劑量肌內(nèi)注射泰地羅新，Tmax為0.51 h，Cmax為0.87 μg/mL，T1/2為100.83 h，AUClast為19.70 μg·h/mL。與以上國內(nèi)報(bào)道相比，其中Tmax、Cmax基本一致，但與趙森[9]和閆超群[11]等報(bào)道的T1/2、AUC有所差異，可能與動(dòng)物品種有關(guān)。

泰地羅新注射液以1 mg/kg BW單劑量靜脈注射于豬后，測(cè)得0～144 h泰地羅新的AUClast、T1/2λz、MRTlast、Vz、Cl分別為3.56±1.62 μg·h/mL、50.91±23.47 h、37.53±4.52 h、17.59±8.09 L/kg、0.31±0.14 L/(h·kg)。上述數(shù)據(jù)表明，泰地羅新靜脈注射給藥后消除緩慢，分布容積大、血漿清除率低。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在豬耳緣靜脈給藥后5 min，血漿藥物濃度較低，明顯低于給藥后10 min的血藥濃度(最高血藥濃度)，說明藥物從耳緣靜脈循環(huán)回心并進(jìn)入體循環(huán)時(shí)存在一個(gè)短暫的延遲時(shí)間。

3.3 生物利用度 將肌內(nèi)注射給藥后藥-時(shí)曲線下面積(AUClastIM)與靜脈注射后藥-時(shí)曲線下面積(AUClastIV)比較，肌內(nèi)注射泰地羅新注射液的絕對(duì)生物利用度為77.15%，說明泰地羅新注射液肌內(nèi)注射給藥吸收較好。該制劑的絕對(duì)生物利用度比已報(bào)道的稍低，可能與動(dòng)物品種及個(gè)體差異有關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究觀察到藥-時(shí)曲線在12～48 h血漿中的藥物濃度出現(xiàn)起伏波動(dòng)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象很有可能是由于大環(huán)內(nèi)酯類藥物主要經(jīng)膽汁排泄，存在肝腸循環(huán)等特點(diǎn)，進(jìn)而出現(xiàn)“雙峰”。另外，個(gè)體間的差異也有可能出現(xiàn)此種現(xiàn)象。同時(shí)由于試驗(yàn)豬機(jī)體的差異，脂肪囤積不同，以及肝腸和腎功能不同及試驗(yàn)期間應(yīng)激也可造成。

本研究闡明了泰地羅新注射液肌內(nèi)注射和靜脈注射后在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征及絕對(duì)生物利用度。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，按照4 mg/kg BW的劑量對(duì)豬肌內(nèi)注射泰地羅新，吸收程度較好，為新獸藥審批和臨床使用提供了新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。