林岳巖 張錫流

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西南寧 530023

水蛭，俗名“螞蝗”，作為中國傳統(tǒng)藥材，是具有破血逐瘀藥效的蟲類藥，主要用于血瘀閉經(jīng)、跌仆損傷等疾病。水蛭素作為水蛭的提取物，其藥理作用主要有抗凝血、抑制血栓形成、抗血小板聚集、抗細(xì)胞凋亡、抗腫瘤、抗纖維化、抗炎、促進(jìn)周圍神經(jīng)再生、促進(jìn)及抗新生血管的雙重作用等，其中以抗凝血、抑制血栓形成、抗腫瘤等作用較為突出。近20年來，越來越多的研究證明[9-12，21-23]，水蛭不光在抗凝血上收效顯著，也在抗腫瘤、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡以及防止腫瘤轉(zhuǎn)移上有著良好功效和研究前景。本研究對水蛭及其有效活性成分在治療惡性腫瘤方面的機(jī)制和作用進(jìn)行較為全面的綜述，同時提出一些新的假設(shè)，為治療惡性腫瘤提供參考。

1 水蛭（leech）

《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]中：“水蛭，味咸，平。主逐惡血、瘀血、月閉、破血瘕積聚、無子、利水道，生池澤。”其在中國各地廣泛分布，于我國北緯32～38°的水田及湖河中常見，生長在不同地域的水蛭其生活習(xí)性與藥用價值不盡相同，亦有吸血水蛭與非吸血水蛭之分，而學(xué)者們將水蛭唾液的提取物稱之為水蛭素，是其發(fā)揮各種作用的主要成分[2]。

2 水蛭素（hirudin）的作用

2.1 抗凝血

水蛭素作為水蛭抗腫瘤治療的主要物質(zhì)，擁有直接抑制腫瘤生長和增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗凝血作用和抗血小板聚集的作用。隨著研究的進(jìn)展發(fā)現(xiàn)[3]，水蛭素中主要能夠發(fā)揮抗凝與抗血栓作用的原因是由水蛭唾液腺中分泌出的一種酸性多肽，這種多肽不僅結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性良好[多肽N端含有相互作用的半胱氨酸（cys），形成了3個二硫鍵]，且能與凝血酶特異性結(jié)合，競爭性抑制凝血酶與纖維蛋白原的結(jié)合過程，在有很好的溶栓、抗凝作用之外，還可以在一定程度上降低血液的黏稠度[4-7]。正是水蛭素相對堅(jiān)固的結(jié)構(gòu)和天然的抗凝血酶特性，這種凝血酶抑制過程獨(dú)立于抗凝血酶Ⅲ，使其相較于臨床抗凝血藥物——肝素，水蛭素能夠更精確的劑量控制，更有利于控制劑量減少副作用，且不會有血小板減少癥出現(xiàn)[8]。

2.2 抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

腫瘤的形成是一個極其復(fù)雜的過程，其是細(xì)胞生長與增殖的調(diào)控發(fā)生嚴(yán)重紊亂的結(jié)果所導(dǎo)致。實(shí)驗(yàn)證實(shí)[9]水蛭提取物能在體外人肝癌細(xì)胞（human hepatocellular carcinomas，HepG2）細(xì)胞中，有直接抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用。且在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中[10]，證實(shí)了水蛭提取物可能夠通過抑制肝癌HepG2細(xì)胞DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）表達(dá)參與抑制腫瘤細(xì)胞增殖。雖然對于DNMT1的抑制遠(yuǎn)弱于對照組（5-Aza-cdR組），但其抑制DNMT3a、DNMT3b作用則明顯優(yōu)于對照組。研究表明[11]，一些腫瘤抑制基因的功能障礙，并非基因結(jié)構(gòu)改變所致，可能由于該基因的啟動子過甲基化且這些過甲基化的啟動子具有腫瘤的特異性所導(dǎo)致。水蛭素能通過某種方式影響肝癌HepG2細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，改變這種基因啟動子過甲基化的狀態(tài)，從而恢復(fù)腫瘤抑制基因功能，重新調(diào)控腫瘤增殖。

2.3 影響腫瘤血管生成

吳秋玲等[12]通過實(shí)驗(yàn)，選用S180可移植性腫瘤細(xì)胞株，制造小鼠移植腫瘤模型用以試驗(yàn)水蛭、斑蝥對腫瘤的作用與機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，水蛭、斑蝥分別對腫瘤血管生成的具有抑制作用，其通過影響雞胚絨毛囊膜（chick chorioallantoic membrane，CAM）新生血管的數(shù)量和面積，以及通過降低S180肉瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor receptor，VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶 -9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表達(dá)降低S180組織中微血管密度（MVD）與抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖來抑制腫瘤血管生成。李小菊等[13]用氯化鈷模擬化學(xué)缺氧的實(shí)驗(yàn)，以MTT法觀察水蛭含藥血清對EA.Hy926細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示水蛭含藥血清可能通過改善腫瘤缺氧微環(huán)境抑制、影響腫瘤血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用，其機(jī)制可能是通過降低缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）蛋白水平和mRNA的表達(dá)，以及降低由HIF-1α所介導(dǎo)的靶基因VEGFmRNA的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的微生物組是腫瘤發(fā)生發(fā)展的另一潛在因素[14]。此外，超過18%的癌癥與感染微生物密切相關(guān)，在發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15-16]。VEGF是一種具有高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，參與許多血管生成依賴性疾病的進(jìn)展，其中包括癌癥以及糖尿病視網(wǎng)膜病變等，其在體外可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，在體內(nèi)則誘導(dǎo)血管增生，尤其是在低氧環(huán)境下，VEGF能與內(nèi)皮細(xì)胞膜上VEGF受體結(jié)合，引起受體的自身磷酸化，從而激活MAPK，實(shí)現(xiàn)VEGF的有絲分裂原特性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生。由此可知，減少VEGF的表達(dá)、緩解細(xì)胞低氧環(huán)境，能從一定程度上影響腫瘤血管的增殖速度進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對腫瘤增殖的控制。影響腫瘤新生血管生長的因子有許多種，可以通過分別觀察水蛭素對于不同因子的影響及其結(jié)果，嘗試發(fā)現(xiàn)新的研究思路與方向?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一種依賴鋅的蛋白水解金屬酶[17]。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶最復(fù)雜的形式之一。MMP-9具有降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分的能力，并在其病理生理功能中發(fā)揮重要作用。MMP-9的過表達(dá)和失調(diào)與多種疾病有關(guān)。因此，調(diào)控和抑制MMP-9是對抗包括癌癥在內(nèi)的各種疾病的重要治療手段。MMP-9抑制劑可作為抗癌藥物。到目前為止，沒有選擇性MMP-9抑制劑通過臨床試驗(yàn)。本文主要就MMP-9的結(jié)構(gòu)、活化、功能和抑制因子等方面進(jìn)行綜述。一些高活性或選擇性的MMP-9抑制劑已經(jīng)被討論，這有助于探索MMP-9抑制劑的結(jié)構(gòu)意義。這項(xiàng)研究對于未來設(shè)計(jì)新的強(qiáng)效和選擇性的MMP-9抗腫瘤抑制劑提供幫助。

2.4 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移

發(fā)生轉(zhuǎn)移是大部分惡性腫瘤的特點(diǎn)，指惡性腫瘤從原發(fā)部位通過侵入淋巴管、血管或體腔，遷移到其他部位并繼續(xù)生長的過程。前文已提及[3-7]水蛭素具有抗血小板聚集和抗凝血的作用，凝血酶在這一過程促進(jìn)血小板聚集，并將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白。在癌癥患者中，由于凝血系統(tǒng)廣泛且過度的激活，直接導(dǎo)致凝血酶的大量產(chǎn)生。在臨床中，約有90%的惡性腫瘤患者，其血液具有高凝狀態(tài)[18]，已有數(shù)據(jù)證實(shí)腫瘤細(xì)胞能夠促進(jìn)血小板的活化[19]，且這種狀態(tài)能一定程度上促使惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移[20]。而具有特異性抑制凝血酶功效的水蛭素則能在解除高凝狀態(tài)的同時，不產(chǎn)生顯著的不良反應(yīng)，這一作用能為抗腫瘤的化學(xué)治療和防止腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的手段[21]。近兩年對于含水蛭經(jīng)方的數(shù)據(jù)挖掘也顯示，水蛭素及其配伍中草藥在治療腫瘤的過程中擁有共同的靶蛋白F2（凝血因子Ⅱ），對于腫瘤起抑制作用[22]。此外腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞外基質(zhì)中存在大量的可溶性或固定的凝血酶，這些凝血酶在一定程度上參與并介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲、細(xì)胞外基質(zhì)降解、以及血管形成和組織的重建。凝血酶受體家族PARs介導(dǎo)凝血酶部分細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)[23]。水蛭素能影響并降低血液的高凝狀態(tài)，從而減少腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。鄭展等[24]也通過研究解毒中藥重樓配伍活血中藥水蛭對肺癌小鼠肺轉(zhuǎn)移灶和血黏度的影響發(fā)現(xiàn)：含水蛭藥劑能顯著抑制小鼠模型的肺癌轉(zhuǎn)移率，其機(jī)制可能與改善血黏度有關(guān)。

3 討論

綜上所述，水蛭主要成分中的水蛭素可通過調(diào)控腫瘤基因表達(dá)、影響惡性腫瘤患者血液中的部分生長因子含量、解除血液高凝狀態(tài)等方式治療惡性腫瘤。這一系列調(diào)控細(xì)胞周期的作用可能主要依賴于作用于PI3K/AKT通路[13]，近年來的研究表明[25-26]，PI3K/AKT信號通路參與了腫瘤進(jìn)展的多個過程，包括細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡。由此提示，水蛭與PI3K/AKT信號通路及其相關(guān)代謝產(chǎn)物與腫瘤增殖的相關(guān)性將成為以后探究水蛭治療惡性腫瘤的主要研究方向。

除調(diào)控細(xì)胞周期外，引起血液高凝狀態(tài)的凝血酶濃度對于腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移是呈雙向性的，一方面在低濃度的時候能夠促進(jìn)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血液高凝促進(jìn)轉(zhuǎn)移，而高濃度的時候則會引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。水蛭素又是否能與這種雙向性影響有一定的相互作用性，值得研究。長期以來對于水蛭的研究，大都是研究水蛭素對凝血酶有何影響，從而判斷其是否有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力，而腫瘤的轉(zhuǎn)移形式并不止局限于單一方式，多數(shù)癌癥除經(jīng)血液途徑的轉(zhuǎn)移外，還伴有淋巴轉(zhuǎn)移等多種方式。未來可嘗試研究水蛭對于抑制腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的效果，試探究水蛭抗腫瘤的新能力。腫瘤產(chǎn)生的機(jī)制復(fù)雜繁瑣，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床對于腫瘤的治療具有理論上的局限性，單一通路治療腫瘤一旦產(chǎn)生耐藥性，將預(yù)示著治療的停止。結(jié)合中藥的“多成分、多通路、多靶點(diǎn)”理念，可以拓寬臨床視野，發(fā)現(xiàn)新的還未被學(xué)者關(guān)注的相關(guān)通路和靶點(diǎn)，即不只把目光放在水蛭素這單一成分對于腫瘤的產(chǎn)生的影響，也可探究水蛭這一藥材整體或是含水蛭組方對于抑制惡性腫瘤各方面的效果。