馮 麗，凡 芳，宋曉英

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，陜西延安716000)

子宮內(nèi)膜異位癥(endo metrio sis，EMS)是女性在育齡期常見的一種疾病，常導(dǎo)致患者盆腹炎癥、疼痛、不孕等癥狀[1]，子宮內(nèi)膜異位癥與雌孕激素及其受體、血管生成等多種因素相關(guān)[2]。VEGF是血管生成的重要調(diào)控因子，通過雌激素介導(dǎo)提高血管壁通透性和促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[3]。MMP-9是鋅離子依賴性內(nèi)膚酶，主要降解細(xì)胞外基質(zhì)，與血管生成、腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。奧美昔芬是雌激素類口服避孕藥，最近有研究表明，奧美昔芬可以通過調(diào)節(jié)血管生成因子VEGF，有效治療生殖系統(tǒng)器質(zhì)性疾病[5]。本研究通過觀察奧美昔芬對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠內(nèi)膜血管生成及ERK-VEGF/MMP-9通路的影響，試圖揭示奧美昔芬作用子宮內(nèi)膜異位癥的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級SD雌性大鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號：SCXK(渝)2012-0001)，體重180～200 g，適應(yīng)飼養(yǎng)2周后用于研究，本研究遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 主要試劑及儀器

奧美昔芬鹽酸鹽(貨號：ZQ78742)購自上海子起生物科技有限公司；p-ERK抗體(貨號：ab184699)、Ang-2(貨號：ab845)、VEGF抗體(貨號：ab69479)、MMP-2抗體(貨號：ab97779)、MMP-9抗體(貨號：ab38898)、辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP)的山羊抗兔二抗(貨號：ab205718)購自Abcam公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(貨號：P0010S)購自上海碧云天公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(貨號：G1120-3)購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白電泳及電轉(zhuǎn)移裝置(型號：AU5800)購自北京市六一儀器廠；電子顯微鏡(型號：GVM-10)購自上海光密儀器有限公司生產(chǎn)；酶聯(lián)免疫分析儀(型號：EVO75)購自澳大利亞Techan公司；透射式電子顯微鏡(型號：H-600)購自日本日立(HITACHI)公司生產(chǎn)；超低溫冰箱(型號：MDF-U32V)購自美國Thermo公司；手術(shù)器械(型號：11231-220-230)購自北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司。

1.3 大鼠模型構(gòu)建及處理

動(dòng)情期大鼠的選取：固定大鼠，將棉簽用生理鹽水打濕后，插入陰道約0.5 cm處取出，均勻地涂在載玻片上，自然風(fēng)干，在固定液中固定30 min，80%乙醇脫色，伊紅染色3 min，無水乙醇脫水，樹膠封片，然后在顯微鏡下觀察各涂片，選取發(fā)情期大鼠。

構(gòu)建模型及分組：動(dòng)物模型構(gòu)建參照文獻(xiàn)[6]將30只大鼠隨機(jī)分為空白組10只、模型組10只、奧美昔芬組10只，建立EM模型：采用自體移植方法，用10%的水合氯醛將大鼠麻醉，剖開其腹部，在左側(cè)子宮角處切下5 mm左右的片段，放入無菌PBS緩沖液中，將子宮內(nèi)膜與子宮肌層分離，迅速移植到大鼠右側(cè)腹壁，縫合傷口，術(shù)后抗感染3天。模型組、試驗(yàn)組大鼠分別皮下注射25 μL的0.9%氯化鈉溶液，10 μmol/L奧美昔芬溶液，連續(xù)用藥42 d。

1.4 子宮內(nèi)膜異位癥模型的鑒定

術(shù)后14 d打開腹腔，肉眼觀察移植物體積增大，呈隆起囊狀，內(nèi)部有積液，表面有血管生成，為判斷模型構(gòu)建成功標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后42 d后，通過光鏡下觀察各組大鼠異位內(nèi)膜組織形態(tài)變化，進(jìn)一步確認(rèn)建模的成功。用游標(biāo)卡尺測量異位病灶的長和寬，通過公式V(體積)=L×W2×0.5，計(jì)算體積。

1.5 用Western blod法檢測各組大鼠子宮異位內(nèi)膜p-ERK、VEGF、MMP-9、Ang-2蛋白表達(dá)

在連續(xù)給藥42 d后，水合氯醛腹腔注射麻醉致死大鼠，在無菌條件下，快速取出組織，生理鹽水沖洗后置于液氮中保存。提取組織總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度后，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、加一抗(1∶1500)在4℃孵育過夜，次日，洗膜加二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，TBST洗膜后，加ECL發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠動(dòng)情周期的判斷結(jié)果

大鼠動(dòng)情前期主要變化是有大量的核上皮細(xì)胞，動(dòng)情期主要為無核角化細(xì)胞，后期有大量多核型細(xì)胞，間期有大量白細(xì)胞(見圖1)。

2.2 異位病灶體積測量結(jié)果

在術(shù)后14 d，與空白組相比，模型組、奧美昔芬組異位病灶體積顯著升高(P<0.05)，模型組和奧美昔芬組，異位病灶體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在術(shù)后48 d，與空白組相比，模型組、奧美昔芬組異位病灶體積顯著升高(P<0.05)，與模型組相比，奧美昔芬組異位病灶體積顯著降低(P<0.05)，術(shù)后14 d、48 d，模型組異位病灶體積顯著升高(P<0.05)，奧美昔芬組異位病灶體積顯著降低(P<0.05，見表1)。

表1 異位病灶體積測量結(jié)果

2.3 光鏡下各組大鼠異位內(nèi)膜組織形態(tài)變化

手術(shù)后42 d，光鏡下觀察空白組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和腺上皮結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，模型組大鼠異位內(nèi)膜呈環(huán)形鋸齒封閉狀，血管數(shù)量較多，基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量多，界限不清，胞核卵圓深染，奧美昔芬組大鼠異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)萎縮，血管數(shù)量少且排列紊亂，間質(zhì)細(xì)胞變小，分布稀疏(見圖2)。

2.4 Western Blot法檢測子宮內(nèi)膜血管生成相關(guān)蛋白Ang-1、Ang-2表達(dá)情況

術(shù)后42 d，與空白組相比，模型組、奧美昔芬組大鼠Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，與模型組相比，奧美昔芬組大鼠Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05，見圖3，表2)。

表2 子宮內(nèi)膜血管生成相關(guān)Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)比較

2.5 Western Blot法檢測ERK-VEGF/MMP-9通路相關(guān)蛋白p-ERK、VEGF、MMP-2、MMP-9表達(dá)情況

術(shù)后42 d，與空白組相比，模型組、奧美昔芬組大鼠p-ERK、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，與模型組相比，奧美昔芬組大鼠p-ERK、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05，見圖4，表3)。

表3 ERK-VEGF/MMP-9通路相關(guān)p-ERK、 VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)比較

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥(EM)是指子宮內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞在子宮腔以外的部位生長發(fā)育，是一種具有慢性炎癥特征的衰弱性疾病。其發(fā)病率逐年上升高達(dá)30%，嚴(yán)重影響了女性的健康[7]。目前對于子宮內(nèi)膜異位癥的治療多以手術(shù)和內(nèi)分泌藥物為主，奧美昔芬是一種非甾體選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，有研究表明[8]，奧美昔芬有抑制細(xì)胞增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究表明，在術(shù)后14 d、48 d，與空白組相比，模型組、奧美昔芬組異位病灶體積顯著升高，在術(shù)后48 d，與模型組相比，奧美昔芬組異位病灶體積顯著降低，異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)萎縮，間質(zhì)細(xì)胞變小，分布稀疏，提示奧美昔芬可以通過抑制細(xì)胞增殖，減小異位病灶的體積。

子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制有許多假說，其中Sampson提出的經(jīng)血逆流，子宮內(nèi)膜經(jīng)過黏附-侵襲-血管生成形成異位病灶，得到大多學(xué)者的認(rèn)可。新血管的生成在子宮內(nèi)膜異位癥形成過程中必不可少[9]。血管生成素1(Angiopoietin 1，Ang-1)、血管生成素2(Angiopoietin 2，Ang-2)是血管生成中的調(diào)控因子，Ang-1與其受體(Tie-2)結(jié)合后，可以促進(jìn)血管成熟，維持血管的功能，Ang-2與Ang-1是拮抗競爭的關(guān)系，Ang-2與受體(Tie-2)結(jié)合后，減少血管的穩(wěn)定性，促進(jìn)新的血管生長[10]。劉敏娟，等[11]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者Ang-1表達(dá)水平高。覃肯，等[12]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥模型鼠的子宮內(nèi)膜中Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)水平顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后48 d，用光學(xué)顯微鏡觀察，與模型組相比，奧美昔芬組血管數(shù)量少，提示奧美昔芬可以抑制血管生成，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，奧美昔芬組大鼠Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)顯著降低，提示奧美昔芬可以降低Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)，抑制血管生產(chǎn)。

異位內(nèi)膜侵襲種植過程與惡性腫瘤細(xì)胞相似，都具有較強(qiáng)的侵襲能力。MAPK激活磷酸化成細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)，參與細(xì)胞內(nèi)外的信息傳遞、VEGF轉(zhuǎn)錄等過程。陶蓉，等[13]研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜異常增殖，與MEK、ERK、VEGF蛋白活性密切相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是調(diào)控血管生成因子，促進(jìn)血管形成，在子宮內(nèi)膜異位癥新血管生成過程中起重要作用。MMP-2、MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶類家族(MMPs)，在血管生成、炎癥、排卵等多種過程中起著重要作用，MMPs在血管生成中主要功能降解細(xì)胞外基質(zhì)[7]。研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥模型鼠體內(nèi)VEGF、p-ERK、MMP-9水平顯著升高[6，14-16]。歐莉，等[17]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥模型鼠體內(nèi)VEGF、MMP-9mRNA和蛋白升高，導(dǎo)致宮內(nèi)膜異常增生。蔣雪梅，等[18]研究發(fā)現(xiàn)，腹壁子宮內(nèi)膜異位癥的病變組織在黏附、血管生成、侵襲等過程與蛋白VEGF、MMP-9密切相關(guān)。有研究表明[19]，奧美昔芬在前列腺癌中可抑可通過抑制MMP2、MMP3表達(dá)，抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，降低細(xì)胞遷移性和侵襲性，本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，奧美昔芬組大鼠p-ERK、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低，提示奧美昔芬可以通過抑制ERK-VEGF/MMP-9通路，降低p-ERK、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)。

綜上所述，奧美昔芬奧美昔芬可能通過抑制ERK-VEGF/MMP-9通路，降低Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)，抑制子宮內(nèi)膜異常增殖和血管生成，但其具體作用機(jī)制尚需深入研究。