田德雨，朱立寧，閆子茹，牛志勇，王勇,，關(guān)軍鋒，趙國群,，劉金龍,*

1(河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊，050018)2(河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊，050018)

梨是我國傳統(tǒng)栽培的主要果樹之一，長期以來我國梨樹種植面積和梨產(chǎn)量均居世界之首[1]。但目前雪梨在采后用于商品化處理的占比較小，其貯藏規(guī)模約占總產(chǎn)量的80%[2]。受季節(jié)、運輸?shù)纫蛩赜绊?，?dǎo)致每年梨果的腐爛率約為20%，這給梨果資源造成極大的浪費。因此，開展雪梨深加工具有重要的現(xiàn)實意義。

梨汁是一種普遍的梨果加工手段，雪梨汁不僅具有酸甜可口等感官特點還富含蛋白質(zhì)、糖、粗纖維等營養(yǎng)物質(zhì)[3]，此外還具有生津、潤燥、清熱、化痰的保健效果[4]，這些優(yōu)勢對消費者來說有著極大的吸引力。但是梨汁的含糖量較高，這限制了部分對糖含量攝入有要求的消費者購買。梨果酒作為一種新型梨加工方式，能解決梨汁含糖量高的問題，即果酒釀造利用酒精發(fā)酵將糖轉(zhuǎn)化為酒精從而降低果汁中的糖含量。目前，市場上部分梨酒加工產(chǎn)品存在品質(zhì)相近、類型單一的問題，此外梨酒還普遍存在口感寡淡和風(fēng)味不佳的問題，梨酒的市場占有率較低。而白酒以其豐富濃郁的香氣特征和獨特的口感深受消費者喜愛，白酒作為一種具有悠久歷史的固態(tài)釀造蒸餾酒[5]，在國內(nèi)有著極高的市場占有率。

本研究結(jié)合果酒釀造與白酒固態(tài)釀造的優(yōu)勢，以雪梨汁和糧食為原料，用梨汁代替水進行潤糧、糟醅拌料、地缸發(fā)酵等獨特工藝，釀造一種新型梨糧共酵蒸餾酒，在優(yōu)化釀造工藝的同時利用氣相色譜-氫離子火焰檢測(gas chromatograph-flame ionization detector,GC-FID)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)對其揮發(fā)性成分進行定性定量分析。采用梨糧共酵的發(fā)酵工藝，期望能充分發(fā)揮白酒的感官特點，利用白酒濃郁醇正的口感和香氣來彌補梨果酒口感寡淡、風(fēng)味不足等缺陷，釀造出一種既具有梨酒風(fēng)味又具有白酒醇厚綿柔口感的新型蒸餾酒。此外，本研究還能為梨的深加工技術(shù)提供新的方向，同時還可以豐富中國白酒品種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱、小麥、糯米、大米、玉米和稻殼等釀酒原料，酒醅、大曲，河北鳳來儀酒業(yè)有限公司；雪梨，市售；HCl、NaOH、酚酞、次甲基藍、葡萄糖等(均為分析純)，天津市百世化工有限公司。

1.2 材料與試劑

NG-DF蒸酒器，釀哥機械設(shè)備有限公司；HH-6恒溫水浴鍋，常州榮華儀器制造有限公司；AOC-20i氣相色譜儀、GC-MS-QP 2010 SE氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；BY101電子天平，南京蘇測計量儀器有限公司；多功能榨汁機，蘇泊爾；FA2204B分析天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；酒精比重計、數(shù)顯溫度計、燒杯、鐵架臺、錐形瓶,蜀中玻璃儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

新型梨糧共酵素蒸餾酒釀造工藝如下：

1.3.2 梨糧共酵蒸餾酒單因素試驗

通過控制變量進行單因素試驗并設(shè)平行實驗，將高粱、糯米、大米、小麥、玉米5種糧食粉碎后按比例混合，以雪梨汁潤糧、潤料各20 min，探究雪梨汁添加量[6%、10%、15%、20%、25%(質(zhì)量分數(shù))]、糧糟質(zhì)量比(1∶2.3、1∶2.8、1∶3.3)、大曲添加量[20%、25%、30%、32%(質(zhì)量分數(shù))]各因素對梨糧共酵蒸餾酒的影響，通過前期預(yù)實驗并參考相關(guān)文獻[6-9]確定糠殼添加量為25%(質(zhì)量分數(shù))、打水量為80%、80～90 ℃、攤晾至22～25 ℃加曲入缸發(fā)酵30 d，以感官評分、總酯、總酸、出酒率進行評價。

1.3.3 正交優(yōu)化試驗

依據(jù)預(yù)實驗及單因素實驗的結(jié)果，選取雪梨汁添加量、糧糟比、大曲添加量3因素進行正交實驗，以感官評價、出酒率、總酯為指標，確定梨糧共酵白酒釀造最佳工藝參數(shù)。利用正交實驗表L9(33)進行試驗，正交試驗的因素和水平如表1所示。

表1 釀造工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Optimization of orthogonal test factors and levels of brewing process

1.3.4 感官評價

感官評價法[10]結(jié)合國家行業(yè)標準，由數(shù)位具有相關(guān)經(jīng)驗的專家組成品酒小組，每款梨糧共酵白酒都以50分為基礎(chǔ)分。剩余50分由4個要素：色澤(滿分5分)、香氣(滿分15分)、滋味(滿分15分)、典型性(滿分5分)對梨糧共酵白酒進行綜合評價，取平均分作為最終評分結(jié)果。

表2 感官評分標準Table 2 Sensory scoring criteria

1.3.5 理化指標檢測

總酸、總酯含量參照GB/T 10345—2007[11]進行測定。

1.3.6 風(fēng)味物質(zhì)成分分析

1.3.6.1 氣相色譜-氫離子火焰檢測

GC-FID條件：白酒專用白毛細柱30 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度260 ℃；分流比30∶1；升溫程序：初始柱溫41 ℃，保持6 min，以3.0 ℃/min升溫到80 ℃，保持2 min，再以8.0 ℃/min 升溫到206 ℃，保持10 min；載氣壓力63.0 kPa，99.999% N2，總流量28.1 mL/min，色譜柱流量0.81 mL/min，吹掃流量3.0 mL/min。進樣量1 μL。

1.3.6.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

色譜條件：色譜柱為Wondacap WAX，30 m×250 μm×0.25 μm，升溫程序：初始柱溫41 ℃，保持6 min，以3.0 ℃/min升溫到80 ℃，保持2 min，再以8.0 ℃/min升溫到206 ℃，保持10 min；進樣口溫度250 ℃，進樣方式：分流，載氣：He(純度≥99.999%)線速度控制，壓力50.0 kPa，總流量31.0 mL/min，柱流量1.00 mL/min，線速度36.1 cm/sec，吹掃流量3.0 mL/min，分流比30∶1。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜為EI離子源，電離能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度220 ℃，檢測器電壓0.1 kV，溶劑延遲1 min。

上述檢測均進行3次平行實驗。

1.3.7 定性、定量分析

定性分析：主要采用GC-MS分析，結(jié)合NIST 11譜庫檢索、人工解譜，同時結(jié)合基峰、特征離子峰等。定量分析：直接進樣，GC-FID結(jié)合GC-MS用峰面積歸一法和內(nèi)標法(內(nèi)標1是乙酸戊酯、內(nèi)標2是2-乙基丁酸)來定量分析各化學(xué)物含量。

1.3.8 氣味活度值評價

采用氣味活度值(odor activity value,OAV)評價各化合物對樣品總體風(fēng)味的貢獻，方法參考SWIEGERS等[12]的研究，氣味活度值的計算公式為OAV=C/T(C為揮發(fā)性香氣成分百分含量；T為感覺閾值)。OAV>1定義為關(guān)鍵風(fēng)味化合物，說明該物質(zhì)可能直接影響總體風(fēng)味；OAV<1定義為修飾性風(fēng)味化合物，說明該物質(zhì)對總體風(fēng)味有修飾作用[13]。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

每組做3個平行樣品檢測結(jié)果，采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

梨汁添加量、糧糟比和大曲添加量均對蒸餾酒中總酯、總酸、感官評價和出酒率這4個評價指標有明顯的影響。不同梨汁添加量、糧糟比和大曲添加量對梨糧共酵蒸餾酒評價指標的影響如圖1所示。

由圖1-a可知，隨著梨汁添加量的增加，總酯和總酸均先增后減，梨汁添加量為15%(質(zhì)量分數(shù))時，總酯(2.118 3 g/L)和總酸(1.319 9 g/L)含量最高。由圖1-b可知，隨著梨汁添加量的增加，感官評分先增后減，出酒率先減后增再減，梨汁添加量15%，感官評分分數(shù)最高94分，出酒率為28.43%。故確定梨汁添加量15%為最佳添加量。

由圖1-c可知，隨著糧糟比例的增大，總酯含量逐漸減少，糧糟質(zhì)量比為1∶2.3時，總酸含量最高為1.159 6 g/L，總酯含量先增后減，糧糟質(zhì)量比為1∶2.8時，總酯含量最高為2.047 7 g/L。由圖1-d可知，隨著糧糟比例的增大，白酒感官評分先升高后降低，糧糟質(zhì)量比為1∶2.8時感官評分最高為93分，出酒率為26.91%。故確定糧糟質(zhì)量比1∶2.8為最佳添加量。

由圖1-e可知，隨著大曲添加量的增加，總酸、總酯含量均先逐漸增加后平緩，當(dāng)大曲添加量為30%(質(zhì)量分數(shù))時，總酯(2.221 3 g/L)和總酸(1.362 3 g/L)含量最高。由圖1-f可知，隨著大曲含量的增加，白酒感官評分逐漸升高后降低，出酒率也如此，當(dāng)大曲添加量為30%時，感官評分最高為94分，出酒率為28.43%。故確定大曲添加量30%為最佳添加量。

a、c、e-梨汁添加量、糧糟質(zhì)量比與大曲添加量對總酯、總酸影響；b、d、f-梨汁添加量、糧糟質(zhì)量比與大曲添加量對感官評分、出酒率的影響圖1 單因素試驗對蒸餾酒的影響Fig.1 Effect of single factor test on distilled wine

2.2 正交優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗對梨汁添加量(A)、糧糟比(B)、大曲添加量(C)3個因素分析，試驗設(shè)計及結(jié)果如表3所示。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進行3因素3水平正交試驗，綜合考察梨汁添加量、糧糟比、大曲添加量對感官評分、出酒率和總酯的影響。由表3可知，以感官評價為評價指標時，各因素影響發(fā)酵結(jié)果的主次順序為大曲添加量(C)>梨汁添加量(A)=糧糟比(B)，最佳釀造工藝參數(shù)組合為A2B1C3，即梨汁添加量15%、糧糟質(zhì)量比1∶2.3、大曲添加量30%。以出酒率為評價指標時，各因素影響發(fā)酵結(jié)果的主次順序為大曲添加量(C)>梨汁添加量(A)>糧糟比(B)，最佳釀造工藝參數(shù)組合為A3B1C3，即梨汁添加量20%、糧糟質(zhì)量比1∶2.3、大曲添加量30%。以總酯含量為評價指標時，各因素影響發(fā)酵結(jié)果的主次順序為大曲添加量(C)>糧糟比(B)>梨汁添加量(A)，最佳釀造工藝參數(shù)組合為A2B1C2，即梨汁添加量15%、糧糟質(zhì)量比1∶2.3、大曲添加量25%。基于多次驗證試驗結(jié)果比較，最終確定最佳釀造工藝組合為A2B1C3，即梨汁添加量15%、糧糟質(zhì)量比1∶2.3、大曲添加量30%。在此優(yōu)化條件下，感官評分92分、出酒率27.86%、總酯含量2.158 4 g/L、總酸含量1.467 5 g/L。梨糧共酵蒸餾酒香氣相對豐富，梨香較為明顯，酒味純正、果香酒香協(xié)調(diào)舒適，酒體清澈無渾濁。

2.3 梨糧共酵蒸餾酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測分析

2.3.1 GC-MS分析梨糧共酵蒸餾酒中揮發(fā)性成分

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對梨糧共酵蒸餾酒香氣成分進行測定。梨酒共酵蒸酒酒樣GC-MS總離子色譜如圖2所示。依照最佳釀造工藝所得到的梨糧共酵蒸餾酒香氣成分經(jīng)過GC-FID和GC-MS分析，詳細鑒定結(jié)果如表4所示。梨糧共酵蒸餾酒中共鑒定出44種揮發(fā)性成分，其中酯類19種、醇類11種、酸類8種、醛類5種、其他類1種，揮發(fā)性成分總量約為4.634 g/L。其中酯類、酸類和醇類物質(zhì)的含量較多，相對含量為48.3%、27.26%和17.09%。梨糧共酵蒸餾酒中主體香氣成分為乙酸乙酯、乙酸、乳酸乙酯、己酸乙酯、己酸、正己醇、乙醛、丁酸、異戊醇，其相對含量分別為20.37%、13.88%、11.91%、9.34%、8.72%、4.53%、3.69%、3.11%、2.89%。經(jīng)過查閱閾值相關(guān)文獻[14-19]和OAV分析可知，44種風(fēng)味化合物中有22種化合物OAV>1，這些化合物對梨糧共酵蒸餾酒有直接影響，這些化合物包含乙酸、己酸、辛酸、異戊酸、正丙醇、正丁醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、油酸乙酯、乙酸異戊酯、棕櫚酸乙酯、乙醛等。

圖2 梨糧共酵蒸餾酒GC-MS總離子色譜Fig.2 GC-MS total ion chromatography of rice co-fermented distilled wine

酯類是具有芳香味的化合物，是形成酒香的主要物質(zhì)，它不僅是衡量白酒品質(zhì)的重要指標，而且對各類型白酒的典型性風(fēng)格起決定性作用；醇類具有襯托酯香的作用，有利于形成獨具特色的酒體風(fēng)格；酸類和醛類對白酒的風(fēng)味起助香、協(xié)調(diào)等作用。梨糧共酵蒸餾酒中酯類是主要的揮發(fā)性成分，其中以乙酯類含量為主，如乙酸乙酯0.944 g/L、乳酸乙酯0.552 g/L、己酸乙酯0.433 g/L、丁酸乙酯0.023 g/L等，其中乙酸乙酯∶乙酸乙酯為1∶2.18、乙酸乙酯∶乳酸乙酯為1∶1.27、乳酸乙酯∶乙酸乙酯為1∶1.81，此外亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯是高級脂肪酸乙酯，具有助香及呈味作用。正己醇具有青草香、糠醇具有焦糖香、丁二醇是多元醇具有甜味，起平衡協(xié)調(diào)作用等；異戊醇、正丙醇、異丁醇是高級醇，起呈香呈味作用，規(guī)定含量不超過2 g/L；甲醇是白酒衛(wèi)生主要指標，規(guī)定含量不超過0.4 g/L。故本蒸餾酒符合衛(wèi)生規(guī)定。乙酸、己酸、正戊酸、異戊酸、異丁酸等成分在酒體中相輔相成，對酒體風(fēng)格起促進作用。乙醛具有清香、麥芽香，起芳香作用。乙縮醛具有水果香，能增加陳綿感，是判斷白酒老熟的標志。

表4 梨糧共酵蒸餾酒揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果Table 4 Identification of volatile components in fermented distillery of pear grain

2.3.2 梨糧共酵蒸餾酒與中國傳統(tǒng)白酒及梨果酒的對比分析

中國傳統(tǒng)白酒與其他蒸餾酒的主要區(qū)別之一是酯類物質(zhì)的種類及含量都比較高。酯類物質(zhì)的種類、含量高低及其與其他香氣成分的比例決定了白酒的風(fēng)格及品質(zhì)[20-21]。白酒主要成分是水和乙醇，約占98%，但決定白酒獨特風(fēng)格的是多種色譜骨架成分和多種微量成分。白酒的色譜骨架成分大約有20多種，由酯類、酸類、醇類等構(gòu)成，占香味成分的95%左右。由表4可知，梨糧共酵蒸餾酒中含有的乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丁酸、己酸、甲醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、苯乙醇、乙醛、乙縮醛等化合物，這些與構(gòu)成中國白酒的色譜骨架成分一致[20-21]；梨糧共酵蒸餾酒的香氣成分與組成中國傳統(tǒng)白酒香氣成分的部分化合物相同[22-29]。

梨糧共酵蒸餾酒與5種其他香型白酒的香氣成分比較分析如圖3-a所示。梨糧共酵蒸餾酒與馥郁香型白酒[22]、清香型白酒[23-24]、濃香型白酒[25-26]、老白干香型白酒[27-28]、兼香型白酒[29]中分別有23、17、26、28、15種化合物一致，以上6種類型的蒸餾酒中都含有丁酸、己酸、乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、乳酸乙酯、苯丙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、糠醛等。因此，梨糧共酵蒸餾酒具有白酒風(fēng)格特征。梨糧共酵蒸餾酒風(fēng)味化合物中乙酸、異丁酸、正己醇、4-甲基戊醇、2,3-丁二醇、十四酸乙酯、十五酸乙酯、亞麻酸乙酯、鄰苯二甲酸二乙酯、己酸異戊酯、對甲基苯酚等是清香型白酒[24-25]中不含或未見報道的成分。乙酸、正戊酸、正己醇、4-甲基戊醇、2,3-丁二醇、乙酸異戊酯、十五酸乙酯、十六碳烯酸乙酯、鄰苯二甲酸二乙酯、乙縮醛、對甲基苯酚等是濃香型白酒[26-27]中不含或未見報道的成分。正戊酸、正戊醇、正己醇、乙酸異戊酯、亞麻酸乙酯、十六碳烯酸乙酯、鄰苯二甲酸二乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、異丁醛、對甲基苯酚等是老白干香型白酒[28-29]中不含或未見報道的成分。乙酯是梨糧共酵蒸餾酒與傳統(tǒng)白酒所共有的風(fēng)味化合物，但是其含量卻存在差異，如本文中梨糧共酵蒸餾酒的乙酸乙酯為0.944 g/L、乳酸乙酯為0.552 g/L、己酸乙酯為0.433 g/L、丁酸乙酯為0.023 g/L；而清香型白酒[25]中乙酸乙酯為1.447 g/L、乳酸乙酯為0.126 g/L、己酸乙酯為0.113 g/L、丁酸乙酯為0.003 g/L；濃香型白酒[27]中乙酸乙酯為0.502 g/L、乳酸乙酯為0.382 g/L、己酸乙酯為1.814 g/L、丁酸乙酯為0.285 g/L；老白干香型白酒[29]中乙酸乙酯為1.477 g/L、乳酸乙酯為1.979 g/L、己酸乙酯為0.003 g/L、丁酸乙酯為0.007 g/L。風(fēng)味物質(zhì)出現(xiàn)差異的原因可能是原料種類、梨汁添加量、大曲品種、發(fā)酵方式和釀造時間等釀造條件不同造成的。

梨糧共酵蒸餾酒與李麗梅等[30]關(guān)于不同品種梨酒揮發(fā)性成分的比較結(jié)果如圖3-b所示。梨糧共酵蒸餾酒與雪梨果酒、五九香梨酒、鴨梨酒、圓黃梨酒、黃冠梨酒、黃金梨酒、香水梨酒及安梨酒中分別有6、7、6、6、7、6、8、6種化合物一致，都含有乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇、硬脂酸乙酯和棕櫚酸乙酯。因此，梨糧共酵蒸餾酒具有梨果酒的風(fēng)味特征。梨糧共酵蒸餾酒有部分化合物在李麗梅等[30]的研究雪梨果酒中未見報道，如乙酸、己酸、異丁酸、甲醇、糠醇、正丙醇、正己醇、異丁醇、乙酸乙酯、己酸己酯、亞油酸乙酯、乙醛、糠醛等。梨糧共酵蒸餾酒與不同品種梨酒的共有化合物含量存在差異，梨糧共酵蒸餾酒中乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇、硬脂酸乙酯和棕櫚酸乙酯的含量均遠高于不同梨品種果酒中所對應(yīng)化合物的含量。造成差異的原因可能是兩者發(fā)酵方式、發(fā)酵菌種等釀造機理的不同。

綜上所述，梨糧共酵蒸餾酒是一種新型兼具梨酒和白酒風(fēng)味的蒸餾酒。

a-梨糧共酵蒸餾酒與中國傳統(tǒng)白酒對比分析； b-梨糧共酵蒸餾酒與梨果酒對比分析圖3 梨糧共酵蒸餾酒與中國傳統(tǒng)白酒及梨果酒分析Fig.3 Analysis of Chinese traditional liquor and pear wine by co-fermented distillation of pear grain

3 結(jié)論

本研究通過單因素及正交試驗得到梨糧共酵蒸餾酒最佳釀造條件為梨汁添加量15%、糧糟質(zhì)量比1∶2.3、大曲添加量30%(質(zhì)量分數(shù))。最終梨糧共酵蒸餾酒的出酒率為27.86%、總酯含量2.158 4 g/L、總酸含量1.467 5 g/L，酒體清澈、酒味純正、果香酒香協(xié)調(diào)舒適。通過GC-MS技術(shù)分析測得44種揮發(fā)性成分，其中酸類8種、醇類11種、酯類19種、醛類5種、其他類1種，揮發(fā)性成分總量約為4.634 g/L，經(jīng)OAV分析確認22種化合物直接影響梨糧共酵蒸餾酒風(fēng)味。梨糧共酵蒸餾酒的色譜骨架成分與傳統(tǒng)中國白酒色譜骨架一致，兼具白酒和梨酒的香氣風(fēng)味特征，是一種風(fēng)格獨特的新型蒸餾酒。

本研究對梨的深加工進行了有益探索，新型梨糧共酵蒸餾酒一定程度上彌補單純梨酒風(fēng)味不足、口感寡淡等問題，充分利用白酒優(yōu)勢釀造出酒體梨香醇正、醇厚綿柔、具有梨果香味和白酒口感的新型蒸餾酒，豐富了白酒品種。為后續(xù)其他水果的果糧共酵或者多種水果復(fù)合的果糧共酵等研究提供一定的依據(jù)，還為開發(fā)新型蒸餾酒提供新的研究方向。