羅彪 周池 陳彥超 周霆 柳初微 周鎮(zhèn)中 陳浩 饒力群 汪啟明

摘要 ：本文以具有抗二化螟性狀的Csu-miR260轉(zhuǎn)基因水稻為試驗(yàn)材料，采用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR（TaqMan RT-qPCR）和莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（stem-loop RT-qPCR）分別對Csu-miR260轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻中Csu-miR260插入序列和剪切形成的amiR260s的表達(dá)情況進(jìn)行了定量檢測。發(fā)現(xiàn)Csu-miR260插入序列和剪切形成的20 nt和21 nt兩種長度amiR260s在轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻苗期的根、莖、葉中表達(dá)，且無組織表達(dá)特異性。該試驗(yàn)解決了人工miRNA作物中amiRNA及前體檢測引物的特異性問題，為人工miRNA植物干擾序列的表達(dá)分析提供技術(shù)參考，并為miRNA轉(zhuǎn)基因作物遺傳表達(dá)相關(guān)安全評價(jià)提供了數(shù)據(jù)參考。

關(guān)鍵詞 ：人工miRNA; 抗蟲水稻; TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR; 莖環(huán)實(shí)時(shí)定量PCR; 轉(zhuǎn)基因安全評價(jià)

中圖分類號：

S 511

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020429

Detection of expression of inserted sequence in Csu-miR260 transgenic rice

LUO Biao1， ZHOU Chi1， CHEN Yanchao1， ZHOU Ting1， LIU Chuwei1，

ZHOU Zhenzhong1， CHEN Hao2， RAO Liqun1， WANG Qiming1*

（1. College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China;

2. National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract

In this article， the expression of insert sequence Csu-miR260 from transgenic rice with resistance to Chilo suppressalis and two length（20 nt and 21 nt） of amiRNA formed by shearing Csu-miR260 were quantitatively determined by using TaqMan probe real-time fluorescent quantitative PCR （TaqMan RT-qPCR） and stem-loop real-time fluorescent quantitative PCR （stem-loop RT-qPCR）. It was found that the expression of the insert sequence Csu-miR260 and amiRNA formed by shearing Csu-miR260 were no tissue specificity in the roots， stems and leaves of the transgenic insect-resistant rice seedlings. This test solves the problem of specificity of amiRNA and precursor detection primers in artificial miRNA crops， provides technical reference for the expression analysis of artificial miRNA plant interference sequences. It also provides a data reference for the safety evaluation of genetic expression in miRNA transgenic crops.

Key words

artificial miRNA; insect-resistant rice; TaqMan RT-qPCR; stem-loop RT-qPCR; safety evaluation of transgenic plants

自1996年以來，轉(zhuǎn)基因作物在全球大面積推廣[1]，有效緩解了農(nóng)作物面臨的病蟲害和營養(yǎng)不足等問題，并帶來了巨大的收益[2]，但轉(zhuǎn)基因作物的安全問題一直是被關(guān)注的熱點(diǎn)[3]。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)不斷發(fā)展，進(jìn)入市場的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品除了轉(zhuǎn)入表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)基因作物[45]，也出現(xiàn)了以表達(dá)的核酸作為殺蟲物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因作物，但是我國目前尚無專門針對此類轉(zhuǎn)基因作物的安全評價(jià)技術(shù)體系[68]。近年來昆蟲特異性miRNA開始用于害蟲的防治，具有很好的應(yīng)用前景[911]。用人工microRNAs（amiRNAs）技術(shù)防治害蟲是一種很有效的策略[12]，其對環(huán)境和非昆蟲物種的負(fù)面影響較小。amiRNAs技術(shù)通過將水稻miR528前體中miR528/miR528*序列替換成昆蟲miRNA/miRNA*序列，再使用組成型啟動子實(shí)現(xiàn)昆蟲miRNA在水稻中的高水平表達(dá)[1314]。二化螟Chilo suppressalis是水稻害蟲之一，給水稻產(chǎn)量帶來巨大的損失[15]。Csu-miR260參與調(diào)節(jié)二化螟的變態(tài)發(fā)育過程，其作用的靶基因?yàn)橥懫に厣锖铣赏緩街械腄ib基因，通過抑制20-羥基蛻皮激素的合成誘導(dǎo)二化螟死亡或?qū)е缕浒l(fā)育遲緩[16]。通過amiRNAs技術(shù)將Csu-miR260引入水稻miR528前體中，能夠獲得有抗蟲效果的Csu-miR260轉(zhuǎn)基因水稻。

外源miRNA的表達(dá)特征和剪切后的序列特征對于轉(zhuǎn)miRNA基因作物的安全性評估非常重要[58]。然而對轉(zhuǎn)基因植物中amiRNA前體的精確加工和是否生成預(yù)期的amiRNA還了解得不充分[13，1719]，amiRNA的形成和沉默效率通常取決于amiRNA的設(shè)計(jì)[2022]，由于轉(zhuǎn)amiRNA基因的植物可能不生成amiRNAs或生成預(yù)測之外的amiRNAs，制約了miRNA轉(zhuǎn)基因植物中miRNA及其前體的檢測。目前有多種檢測轉(zhuǎn)基因植物中miRNA及其前體的方法，如Northern blot[23]、微陣列、定量RT-PCR和高通量測序等。Northern blot復(fù)雜耗時(shí)，檢測miRNAs靈敏度低;定量RT-PCR由于動態(tài)范圍最廣、準(zhǔn)確度最高，常被用作RNA定量的金標(biāo)準(zhǔn)[24]。莖環(huán)法，加尾法等定量RT-PCR技術(shù)常用來檢測成熟miRNA的表達(dá)[2526]，但由于Csu-miR260轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)入的Csu-miR260和水稻miR528前體序列高度同源，SYBR Green 染料法無法準(zhǔn)確區(qū)分，其次人工Csu-miR260替換片段長度為27 bp，超過21 bp，限制了amiRNA特異性引物的設(shè)計(jì)。因此本研究采用基于qRT-PCR的TaqMan探針法和莖環(huán)法分別對Csu-miR260轉(zhuǎn)基因水稻中Csu-miR260插入序列以及成熟miR260進(jìn)行定量檢測，以期為Csu-miR260轉(zhuǎn)基因作物的安全性評估奠定基礎(chǔ)，并為其他miRNA轉(zhuǎn)基因植物的特異性檢測提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻株系‘Csu-miR260-16’‘Csu-miR260-18’和野生型‘中花11’，培養(yǎng)室生長至3～4葉期?！瓹su-miR260-16’的插入位點(diǎn)位于1號染色體11863348-11863480處，插入片段長5 086 bp，‘Csu-miR260-18’的插入位點(diǎn)位于4號染色體31311317-31311395處，插入片段長4 973 bp。轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化元件構(gòu)建如圖1所示。osa-miR260全長251 bp，其中水稻miR528前體中21 nt miR528/miR528*替換成27 nt的二化螟miR260/miR260*，下文稱其為Csu-miR260插入序列。

試劑：TRIzol試劑，上海ThermoFisher公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Mix，2×T5 Fast qPCR Mix （Probe），長沙擎科生物公司;miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒（莖環(huán)法），上海生工生物工程公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取

采用TRIzol法分別提取苗期‘Csu-miR260-16’‘Csu-miR260-18’和‘中花11’的根、莖、葉RNA。使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測量RNA濃度。

1.2.2 TaqMan RT-qPCR檢測Csu-miR260插入序列

1.2.2.1 探針設(shè)計(jì)

由于Csu-miR260插入序列與Osa-miR528前體高度同源，設(shè)計(jì)特異性探針和引物（圖2）。引物和探針由擎科生物公司合成（表1）。

1.2.2.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品合成

制備Csu-miR260插入序列的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，其中Csu-miR260插入序列251 bp （圖2b），載體序列1 818 bp，總共2 069 bp，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品由擎科生物公司合成。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以10倍梯度法稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-55個(gè)梯度，分別以稀釋液為模板進(jìn)行TaqMan RT-qPCR。測量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品OD 260，按照OD 260=1時(shí)dsDNA濃度為50 ng/μL計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，再根據(jù)拷貝數(shù)=6.023×（a/b）×1014計(jì)算不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，其中a為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（ng），b為質(zhì)粒分子量（g/mol）。PCR擴(kuò)增效率計(jì)算公式En=[10（-1/c）-1]×100%，c為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.2.2.4 cDNA合成

以RNA為模板合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：總RNA 1 μg， gDNA remover 1 μL， 10×gDNA remover buffer 1 μL，補(bǔ)充RNase free H 2O至10 μL。充分混勻，短暫離心后將離心管置于PCR儀中42℃孵育2 min，60℃孵育5 min，去除基因組DNA。再轉(zhuǎn)移至冰上迅速冷卻，加入4 μL Goldenstar_RT6_cDNA_Synthesis_Mix，補(bǔ)足RNase free H 2O至20 μL。充分混勻，短暫離心后，將離心管置于PCR儀中50℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min，85℃ 5 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活，得到cDNA。

1.2.2.5 TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

以cDNA為模板進(jìn)行TaqMan RT-qPCR。反應(yīng)體系：2×T5 Fast qPCR Mix（probe）10 μL，10 μmol/L miR260-F、miR260-R各0.7 μL，10 μmol/L探針0.6 μL，cDNA 2 μL，ddH 2O 補(bǔ)足至20 μL。TaqMan熒光定量反應(yīng)程序：第1步95℃預(yù)變性2 min;第2步95℃變性10 s;第3步60℃延伸30 s。第3步收集熒光信號，第2步至第3步40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。采用絕對定量方法檢測Csu-miR260插入序列的拷貝數(shù)，制作Csu-miR260插入序列質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將各待測樣品RNA按1 μg反轉(zhuǎn)錄，最后將各待測樣定量PCR的C t值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算拷貝數(shù)。

1.2.3 莖環(huán)RT-qPCR檢測成熟amiR260s

通過小RNA測序發(fā)現(xiàn)‘Csu-miR260-16’和‘Csu-miR260-18’中amiR260s長度集中分布在20 nt和21 nt（表2）。為了驗(yàn)證和明確這兩條amiR260s序列在各組織表達(dá)情況，采用莖環(huán)RT-qPCR對其在組織中的表達(dá)進(jìn)行定量檢測。

1.2.3.1 莖環(huán)引物設(shè)計(jì)

根據(jù)20 nt和21 nt amiR260序列特征設(shè)計(jì)莖環(huán)引物（表3）。

1.2.3.2 cDNA合成

以RNA為模板合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：總RNA 3 μg， miRNA L-RT Enzyme mix 1.5 μL，2×miRNA L-RT Solution mix 10 μL，10 μmol/L Stem-loop primer 1 μL， RNase free H 2O補(bǔ)足至20 μL。輕輕混勻后離心3～5 s，反應(yīng)混合物16℃溫浴30 min，然后37℃溫浴30 min，85℃加熱5 min使酶失活，4℃保存。

1.2.3.3 SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR

反應(yīng)體系：2×T5 Fast qPCR Mix 10 μL，cDNA 1 μL，正向引物260F20或260F21和通用反向引物260R 各0.8 μL，補(bǔ)充 RNase free H 2O至 20 μL。PCR反應(yīng)程序（三步法）：95℃ 1 min; 95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：95℃15 s，60℃ 1 min，95℃15 s，60℃ 15 s。試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。相對定量使用2-ΔΔCt法計(jì)算，ΔΔC t =（C t目標(biāo)基因-C t內(nèi)參基因） 試驗(yàn)組-（C t目標(biāo)基因-C t內(nèi)參基因） 對照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取結(jié)果

使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測量苗期根、莖、葉RNA的純度，結(jié)果顯示其OD 260/OD 280在1.8～2.1之間。電泳結(jié)果顯示28S和18S條帶清晰（圖3），表明RNA整體質(zhì)量較好，能滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2 TaqMan RT-qPCR檢測Csu-miR260插入序列

2.2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品堿基數(shù)為2 069 bp，分子量為1 365 540，OD 260平均值為2.563，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為128.2 ng/μL。1 ng質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為439 386 616個(gè)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行TaqMan RT-qPCR，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2大于0.99，并且斜率為-3.344，在-3.1～-3.5的范圍內(nèi)，PCR擴(kuò)增效率En=99.1%，在90%～110%之間，符合標(biāo)準(zhǔn)曲線條件。

2.2.3 TaqMan RT-qPCR檢測結(jié)果

TaqMan熒光定量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增曲線起峰集中分布在C t值22和C t值33兩處，‘Csu-miR260-16’和‘Csu-miR260-18’的各組織樣品皆在C t值22左右起峰，野生型各組織樣品和陰性對照C t值皆在33左右。該結(jié)果說明TaqMan探針能明顯區(qū)分Csu-miR260插入序列和內(nèi)源miR528前體序列，表明了探針法對Csu-miR260插入序列的檢測具有高特異性。

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Csu-miR260轉(zhuǎn)基因水稻各組織中Csu-miR260插入序列表達(dá)的拷貝數(shù)（圖5），發(fā)現(xiàn)Csu-miR260插入序列在‘Csu-miR260-16’和‘Csu-miR260-18’各組織中表達(dá)的拷貝數(shù)基本一致。說明在泛素啟動子的作用下，Csu-miR260轉(zhuǎn)基因水稻實(shí)現(xiàn)了Csu-miR260插入序列在各組織中高效且等量表達(dá)。Csu-miR260插入序列的正常轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定表達(dá)，為其產(chǎn)生成熟的miR260和達(dá)到相應(yīng)抗蟲劑量提供了核酸基礎(chǔ)。

2.3 莖環(huán)RT-qPCR檢測成熟amiR260s

Csu-miR260插入序列在水稻Dicer-like1（DCL1）酶[27]加工下形成20 nt和21 nt兩種長度的amiR260s，通過莖環(huán)RT-qPCR對這兩種長度的amiR260s進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證以及組織特異性表達(dá)分析（圖6），發(fā)現(xiàn)20 nt和21 nt兩種長度的amiR260s均在‘Csu-miR260-16’和‘Csu-miR260-18’中表達(dá)，且無組織表達(dá)特異性，這與Csu-miR260插入序列在各組織表達(dá)特征相同。說明在泛素啟動子的作用下，Csu-miR260轉(zhuǎn)基因水稻分別實(shí)現(xiàn)了Csu-miR260插入序列和成熟amiR260s的無組織特異性表達(dá)。Csu-miR260插入序列的成功剪切和amiR260s的各組織穩(wěn)定表達(dá)為其抗蟲功能分析奠定了分子基礎(chǔ)。

3 討論

擬南芥和水稻中Dicer-like1酶一般剪切前體miRNA生成21 nt成熟的miRNA[14，17，28]，amiRNA技術(shù)中替換片段也普遍在21 bp左右[14，24，29]。對于人工miRNA轉(zhuǎn)基因植物的鑒定和表達(dá)檢測通常也是針對預(yù)測的21 bp amiRNA來設(shè)計(jì)引物或探針，但對于更長的amiRNA替換片段的檢測，由于預(yù)測序列未知，制約了人工miRNA植物的鑒定和檢測。本文通過小RNA測序發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入的Csu-miR260的27 nt序列在水稻體內(nèi)被加工成20 nt和21 nt兩個(gè)RNA片段，通過莖環(huán)法對兩個(gè)片段進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該結(jié)果與植物Dicer-like1酶的剪切功能相符，說明不同長度amiRNA替換片段在植物內(nèi)形成了21 nt左右amiRNAs。通過分析兩個(gè)片段的序列，發(fā)現(xiàn)amiRNA的檢測引物應(yīng)該根據(jù)替換片段5′端起的21 nt的序列來設(shè)計(jì)，該結(jié)果為人工miRNA轉(zhuǎn)基因植物amiRNAs的特異檢測提供技術(shù)參考，同時(shí)也為amiRNAs技術(shù)在植物中的設(shè)計(jì)提供參考。本試驗(yàn)建立的基于實(shí)時(shí)定量PCR的TaqMan探針法檢測miRNA前體以及莖環(huán)法檢測miRNAs的方法具有操作簡單、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可作為人工miRNA和發(fā)夾RNAi等類型的轉(zhuǎn)基因植物中功能序列表達(dá)檢測方法，以促進(jìn)對各類miRNA的功能研究。

本文對Csu-miR260轉(zhuǎn)基因水稻的Csu-miR260插入序列和成熟amiR260s進(jìn)行了定量分析，明確了其表達(dá)模式，即在組成型泛素啟動子作用下，Csu-miR260插入序列和成熟amiR260s在各組織中穩(wěn)定表達(dá)且無組織特異性，為Csu-miR260轉(zhuǎn)基因水稻遺傳表達(dá)提供了詳細(xì)準(zhǔn)確的安全評價(jià)數(shù)據(jù)。其次，本研究發(fā)現(xiàn)Csu-miR260轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)生了非預(yù)期的人工miRNA片段，即27 nt Csu-miR260在水稻中形成了20 nt和21 nt兩個(gè)新的RNA片段。因此miRNA轉(zhuǎn)基因水稻安全性評估中應(yīng)側(cè)重于對新引入的兩個(gè)RNA片段的安全性評估[78]，即新的amiRNA是否導(dǎo)致水稻內(nèi)源基因的非預(yù)期沉默，同時(shí)要評價(jià)新的amiRNA的抗蟲效果，20 nt和21 nt兩個(gè)新的人工miRNA片段的抗螟蟲效果是否與27 nt Csu-miR260的抗螟蟲效果一致?？瓜x效果的下降或消失等都會影響Csu-miR260轉(zhuǎn)基因水稻的商品化。因此對于該類型的轉(zhuǎn)基因作物可以進(jìn)行額外的測試來評估任何預(yù)期或非預(yù)期的成分變化帶來的安全性問題和功能效率問題。本試驗(yàn)明確了Csu-miR260插入序列和成熟amiR260s的序列特征以及組織表達(dá)特征，為Csu-miR260轉(zhuǎn)基因水稻的安全性評價(jià)提供了準(zhǔn)確的插入序列表達(dá)數(shù)據(jù)，同時(shí)為該類型轉(zhuǎn)基因作物的安全評價(jià)提供數(shù)據(jù)參考，以促進(jìn)miRNA轉(zhuǎn)基因作物安全性評價(jià)方法的進(jìn)一步完善。

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（責(zé)任編輯：田 喆）