汪群智 盛美玲 郭安

[摘要] 目的 基于宏基因組高通量測序探討非嗜酸性粒細胞與嗜酸性粒細胞炎癥表型的支氣管哮喘患者下呼吸道微生物群差異，進一步了解呼吸道微生物群變化與哮喘炎癥表型的關系。 方法 選取2019年1—12月間我院就診的支氣管哮喘患者80例作為研究對象，對所有患者行誘導痰檢查，利用Miseq PE300平臺進行誘導痰標本上機高通量測序。 結果 支氣管哮喘患者下呼吸道微生物群組成非常豐富，門水平上主要以厚壁菌門（45.35%）、擬桿菌門（18.12%）、變形菌門（16.48%）、放線菌門（10.47%）、梭桿菌門（4.50%）為主，屬水平上主要以鏈球菌屬（24.35%）、韋榮氏球菌屬（12.91%）、普雷沃氏菌屬（7.72%）、假單胞菌屬（4.03%）、羅氏菌屬（3.92%）、嗜血桿菌屬（3.17%）為主。非嗜酸性粒細胞與嗜酸性粒細胞哮喘患者誘導痰中微生物多樣性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。門水平上，非嗜酸性粒細胞型哮喘患者誘導痰中擬桿菌門、梭桿菌門豐度明顯升高[（21.43±3.95）% vs. （14.77±3.16）%，P=0.0318;（6.58±1.02）% vs. （3.27±0.74）%，P=0.0443）];屬水平上，非嗜酸性粒細胞型哮喘患者誘導痰中假單胞菌屬、嗜血桿菌屬、葡萄球菌屬豐度明顯升高[（8.51±1.27）% vs. （1.77±0.44）%，P=0.0325;（8.22±1.04）% vs. （1.53±0.36）%，P=0.0223;（4.11±0.65）% vs. （2.43±0.37）%，P=0.0492]。 結論 非嗜酸性粒細胞型哮喘與嗜酸性粒細胞型哮喘患者誘導痰中擬桿菌門、梭桿菌門，假單胞菌屬、嗜血桿菌屬、葡萄球菌屬豐度存在明顯差異。

[關鍵詞] 微生物群;呼吸道;支氣管哮喘;高通量測序

[中圖分類號] R731.4? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）31-0031-05

[Abstract] Objective To investigate the difference of lower respiratory tract microbiota in bronchial asthma patients with non-eosinophil and eosinophil inflammatory phenotypes based on metagenomic high-throughput sequencing，and to further understand the relationship between respiratory microbiota changes and inflammatory asthma phenotypes. Methods A total of 80 patients with bronchial asthma who visited our hospital from January to December 2019 were selected as the study subjects.All patients underwent induced sputum examination.High-throughput sequencing of induced sputum samples was performed using MiseqPE300 platform. Results The composition of lower respiratory tract microbiota in patients with bronchial asthma was very abundant，mainly Firmicutes（45.35%），Bacteroidetes（18.12%），Proteobacteria（16.48%），Actinobacteria（10.47%），and Fusobacteria（4.50%）at the phylum level，and Streptococcus（24.35%），Veillonella（12.91%），Prevotella（7.72%），Pseudomonas（4.03%），Roche（3.92%），and Haemophilus（3.17%）at the genus level.There was no significant difference in microbial diversity in induced sputum from non-eosinophilic and eosinophilic asthma patients.At the phylum level，the abundance of Bacteroidetes and Fusobacteria in induced sputum was significantly increased in patients with non-eosinophilic asthma[（21.43±3.95）% vs. （14.77±3.16）%， P=0.0318; （6.58±1.02）% vs. （3.27±0.74%）， P=0.0443].At the genus level，the abundance of Pseudomonas，Haemophilus，and Staphylococcus species in induced sputum was significantly increased in patients with non-eosinophilic asthma[（8.51±1.27）% vs. （1.77±0.44）%，P=0.0325; （8.22±1.04）% vs. （1.53±0.36）%，P=0.0223; （4.11±0.65）% vs. （2.43±0.37）%， P=0.0492]. Conclusion There are significant differences in the abundance of Bacteroidetes，F(xiàn)usobacteria，Pseudomonas，Haemophilus，and Staphylococcus in induced sputum between patients with non-eosinophilic asthma and eosinophilic asthma.

[Key words] Microbiota; Respiratory tract; Bronchial asthma; High-throughput sequencing

支氣管哮喘是全球范圍內最常見的呼吸道慢性炎癥性疾病之一，是全球關注的重要公共衛(wèi)生問題。其中重癥哮喘[1]是指過去1年中一半以上的時間內需要給予高劑量長效β受體激動劑聯(lián)合吸入性糖皮質激素和（或）白三烯受體拮抗劑/緩釋茶堿，或全身激素治療才能維持疾病的控制，或即使使用上述治療病情仍得不到有效控制的哮喘，急診就醫(yī)率和住院率是輕中度哮喘15～20倍，且住院率及死亡率明顯增加。哮喘的炎癥表型研究發(fā)現(xiàn)[2]，重癥哮喘更多見于非嗜酸性粒細胞型哮喘，不同的哮喘炎癥表型患者有著明顯不同的治療反應和病程。已有較多研究表明，呼吸道微生物群與哮喘的發(fā)病及疾病進展存在重大關聯(lián)，且呼吸道微生物群在不同的哮喘嚴重程度中亦具有一定差異[3-4]。故而，進一步了解呼吸道微生物群變化與哮喘炎癥表型的關系，有著重要的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1—12月在我院呼吸內科門診就診及出院后隨訪的臨床緩解期支氣管哮喘患者80例作為研究對象。非嗜酸性粒細胞型哮喘組患者47例（A組），其中男22例，女25例;平均年齡（42.15±14.33）歲。嗜酸性粒細胞型哮喘組患者33例（B組），其中男16例，女17例;平均年齡（43.31±15.12）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.882、0.982），具有可比性。

1.2 納入與排除標準

參考哮喘的診斷符合支氣管哮喘全球防治倡議（The global initiative for asthma，GINA）制定的《Global strategy for asthma management and prevention：Update 2017》[5]中規(guī)定的相關標準，納入標準：①18～75歲;②哮喘病史≥1年;③支氣管舒張試驗陽性;④目前均處于疾病慢性持續(xù)期或臨床緩解期，且近8周內患者呼吸道癥狀如喘息、咳嗽穩(wěn)定;⑤近4周內沒有接受抗感染藥物的使用或激素的使用。排除標準：①有其他相關肺病如慢性阻塞性肺病、肺部腫瘤、結核、支氣管擴張、變應性支氣管肺曲霉菌病、變應性肉芽腫性血管炎等;②目前或既往接受過敏原免疫治療;③有嚴重肺外器官器質性病變、自身免疫性疾病、癌癥、不方便交流的患者;④哺乳期婦女、孕婦等;⑤治療不充分、治療依從性差、吸入技術掌握不佳及存在未去除誘因的哮喘患者，誘因包括鼻-鼻竇炎/鼻息肉、焦慮抑郁等心理因素、聲帶功能障礙、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征、高通氣綜合征、甲狀腺疾病、服用非甾體類藥物、β受體阻滯劑、血管緊張素轉化酶抑制劑等藥物。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 誘導痰取樣檢查及炎癥細胞分類? 對所有患者行誘導痰取樣，依據(jù)文獻[6]方式進行誘導痰檢查及炎癥細胞分類。受試者吸入沙丁胺醇氣霧劑200 μg，15 min后霧化吸入高滲鹽水20 mL，收集0.5 h內痰液。去除唾液成分，痰液計量后加入相當于二硫蘇糖醇，震蕩15 min混勻。以離心半徑8 cm，2000 r/分離心10 min后，將上清液放置于-80℃冰箱內保存用以檢測。取沉淀層進行痰涂片，Wright-Giemsa染色后高倍鏡下計數(shù)300～600個有核細胞，計算有核細胞比例。其中，非嗜酸性粒細胞型哮喘（包括中性粒細胞型哮喘：痰中性粒細胞比例>61%;少粒細胞型哮喘：痰嗜酸粒細胞<3%，中性粒細胞<61%;混合粒細胞型哮喘：痰嗜酸粒細胞>3%且中性粒細胞>61%）組患者47例（A組）;嗜酸性粒細胞型哮喘（痰嗜酸粒細胞比例≥3%）組患者33例（B組）。

1.3.2 痰脫氧核糖核酸抽提和PCR擴增? 根據(jù)脫氧核糖核酸（Deoxyribo nucleic acid，DNA）抽提試劑盒（Omega bio-tek，Norcross，GA，U.S）注明的步驟方法進行細菌總DNA的提取，DNA質量控制使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再進一步對V3-V4可變區(qū)進行聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction，PCR）擴增，擴增引物：806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）;338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）。

1.3.3 高通量測序? 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，再進一步純化。根據(jù)Illumina MiSeq平臺的相關操作流程將純化的擴增片段進一步行文庫構建（PE2×300）。再使用Illumina公司生產(chǎn)的Miseq PE300平臺高通量測序分析痰液菌群的相關成分。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，非正態(tài)分布參數(shù)用中位數(shù)和四分位間距表示。參數(shù)呈正態(tài)分布時，兩組間比較采用t檢驗，參數(shù)呈非正態(tài)分布時，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，圖表制作使用GraphPad Prism 8.0軟件處理。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料

非嗜酸性粒細胞型哮喘組患者47例（A組），其中男22例，女25例;平均年齡（42.15±14.33）歲。嗜酸性粒細胞型哮喘組患者33例（B組），其中男16例，女17例;平均年齡（43.31±15.12）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.022、t=-0.023，P=0.882、0.982）。

2.2 80例標本稀釋曲線

曲線走向趨向平坦時，提示測序的數(shù)據(jù)量已足夠，上圖可以看出，所有標本曲線都走向平坦，提示送檢標本的測序數(shù)據(jù)量合理。見圖1。

2.3 80例痰標本α多樣性分析

兩組標本間誘導痰菌群在多樣性上比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1、圖2。

2.4 誘導痰菌群組成

哮喘患者誘導痰菌群組成豐富，門水平上主要以厚壁菌門（45.35%）、擬桿菌門（18.12%）、變形菌門（16.48%）、放線菌門（10.47%）、梭桿菌門（4.50%）等為主，屬水平上主要以鏈球菌屬（24.35%）、韋榮氏球菌屬（12.91%）、普雷沃氏菌屬（7.72%）、假單胞菌屬（4.03%）、羅氏菌屬（3.92%）、嗜血桿菌屬（3.17%）等為主。見封三圖1～2。

2.5 兩組患者誘導痰標本微生物群在門水平及屬水平上的豐度差異分析

在門水平上，A組患者誘導痰中擬桿菌門、梭桿菌門豐度明顯高于B組[（21.43±3.95）% vs. （14.77±3.16）%，P=0.0318;（6.58±1.02）% vs. （3.27±0.74）%，P=0.0443）];在屬水平上，A組患者誘導痰中假單胞菌屬、嗜血桿菌屬、葡萄球菌屬豐度明顯高于B組[（8.51±1.27）% vs. （1.77±0.44）%，P=0.0325;（8.22±1.04）% vs. （1.53±0.36）%，P=0.0223;（4.11±0.65）% vs. （2.43±0.37）%，P=0.0492]。菌群豐度在其他門、屬水平上相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖3～4。

3 討論

目前有很多研究發(fā)現(xiàn)[7-9]，呼吸道內的微生物群與哮喘的發(fā)病及疾病進展存在重大關聯(lián)。流行病學調查顯示，哮喘的發(fā)病率與患者早期微生物接觸史明顯相關[10-11]。呼吸道標本培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)出流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、肺炎鏈球菌等細菌的兒童發(fā)生哮喘的比例明顯增加，這些細菌的定植可引起持續(xù)性的喘息，且與哮喘的嚴重程度和病情的急性加重有關[12]。近年來，對細菌的16S核糖體RNA進行測序的宏基因組學高通量測序法的發(fā)展規(guī)避了傳統(tǒng)培養(yǎng)法的局限，可全面反映呼吸道微生物群的結構以及功能特點[13]。

2010年Hilty等[14]第一次描述了哮喘患者和健康人群的呼吸道內相關微生物組成的差異，和健康人群相比，哮喘患者呼吸道中嗜血菌屬、奈瑟球菌屬明顯增加，而普雷沃桿菌屬明顯減少，提示哮喘患者呼吸道內微生物群失衡，并且哮喘患者中普雷沃氏菌含量的減少可能對哮喘的病情加重起著不可或缺的作用。Marri等[15]的研究表明哮喘患者肺部的微生物種類明顯高于正常對照組，并發(fā)現(xiàn)氣道微生物群的種類和相關豐度的變化與氣道的反應性有密切相關性。本研究通過對80例哮喘患者誘導痰行高通量測序研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者誘導痰微生物群在門水平上主要以厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、梭桿菌門為主，而屬水平上主要以鏈球菌屬、韋榮氏球菌屬、普雷沃氏菌屬、假單胞菌屬、羅氏菌屬、嗜血桿菌屬為主，與相關研究結果基本一致[15]。

很多研究發(fā)現(xiàn)不同的哮喘氣道炎癥表型的患者有著明顯不同的臨床病程和治療反應，重癥哮喘更多見于非嗜酸性粒細胞型哮喘，而輕中度哮喘更多見于嗜酸性粒細胞型哮喘[16-17]，故而，進一步了解呼吸道微生物群變化與哮喘炎癥表型的關系，有著較大的臨床意義。有研究發(fā)現(xiàn)[18]，哮喘患者呼吸道內嗜血桿菌屬、葡萄球菌屬能夠一定程度地誘導氣道嗜酸性粒細胞脫顆粒和趨化因子的分泌，葡萄球菌屬能進一步誘導白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α的產(chǎn)生，而嗜血桿菌屬能誘導IL-10的產(chǎn)生。葡萄球菌屬毒素可以使人體產(chǎn)生的IgE抗體，與哮喘病程發(fā)展的危險程度密切相關;部分研究發(fā)現(xiàn)嗜血桿菌屬與新生兒哮喘的臨床癥狀存在相關性，能夠促使激素抵抗型中性粒細胞型哮喘的發(fā)生，而葡萄球菌屬不是哮喘患者病情進展的危險因素[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定期重癥哮喘患者肺部嗜血桿菌屬、肺炎鏈球菌和卡他莫拉菌豐度的升高和痰液中的中性粒細胞水平及與肺功能的下降呈正相關[20]。這些研究結論的差別可能受到微生物群所處的微環(huán)境情況的影響或微生物群與嗜酸性粒細胞不同的受體相結合時所表現(xiàn)出不同的反應有關。本研究顯示，非嗜酸性粒細胞型哮喘患者呼吸道內假單胞菌屬、嗜血桿菌屬、葡萄球菌屬豐度較嗜酸性粒細胞患者明顯升高，提示呼吸道內假單胞菌屬、嗜血桿菌屬、葡萄球菌屬豐度的增加可能與哮喘患者的病情加重及對治療反應不佳有一定的關系，與國外學者相關研究結果較為一致[20-21]。Ver等[21]研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道內嗜血桿菌屬的豐度增加與重癥哮喘病情的發(fā)生發(fā)展有一定相關性，推測機制可能與嗜血桿菌屬激活患者呼吸道內固有免疫系統(tǒng)，引起固有免疫相關受體（Toll-like receptors-2，TLR2）、TLR4和細胞因子IL-8和IL-1β的信使核糖核酸表達增加，從而導致哮喘反復難以控制;而假單胞菌屬及葡萄球菌屬豐度的增加可以導致呼吸道感染的加重且明顯增加廣譜抗生素的使用，從而引起病情反復發(fā)作難以控制[18]。

目前已經(jīng)有很多學者研究微生物的相關功能與哮喘的關系，Lee等[22]利用宏基因組學技術分析，在青年哮喘患者中，與戊糖磷酸代謝途徑、脂多糖的生物合成、鞭毛組裝和細菌趨化性有關的基因表達均較高，這些基因可能與增強氣道炎癥反應以及引起致病菌定植增加有關。Chiu等[23]發(fā)現(xiàn)，哮喘患者呼吸道微生物碳水化合物代謝、氨基酸代謝有關的基因表達豐富，組氨酸代謝和糖胺聚糖降解、多環(huán)芳烴降解基因出現(xiàn)耗竭。故而，難治性哮喘患者呼吸道內微生物亦可能存在部分功能基因的變化，從而引起哮喘反復發(fā)作難以控制，需要今后做進一步深入探討。

綜上所述，支氣管哮喘患者呼吸道內的菌群非常豐富，主要以鏈球菌屬、韋榮氏球菌屬、普雷沃氏菌屬、假單胞菌屬、羅氏菌屬、嗜血桿菌屬等為主，非嗜酸性粒細胞型哮喘與嗜酸性粒細胞型哮喘患者呼吸道菌群在多樣性分布上并無顯著差異，但是非嗜酸性粒細胞型哮喘患者呼吸道內擬桿菌門、梭桿菌門及假單胞菌屬、嗜血桿菌屬、葡萄球菌屬豐度明顯高于嗜酸性粒細胞型哮喘患者，提示相關微生物群的豐度變化與哮喘炎癥表型存在一定的相關性。但是，目前微生物高通量測序費用比較昂貴，本研究完成的檢測標本數(shù)量較少，以后需要擴大測序樣本量以進一步確認及修正目前的研究數(shù)據(jù)。

[參考文獻]

[1] 中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組.支氣管哮喘防治指南（2016年版）[J].中華結核和呼吸雜志，2016，39（9）：675-697.

[2] Tanaka A，Sato H，Akimoto K，et al.Spontaneous sputum discriminates inflammatory phenotypes in patients with asthma[J].Ann Allergy Asthma Immunol，2020，126（1）：54-60.

[3] Al Bataineh MT，Hamoudi RA，Dash NR，et al.Altered respiratory microbiota composition and functionality associated with asthma early in life[J].BMC Infect Dis，2020， 20（1）：697.

[4] Borbet TC，Zhang X，Müller A，et al.The role of the changing human microbiome in the asthma pandemic[J].J Allergy Clin Immunol，2019，144（6）：1457-1466.

[5] ED Bateman，SS Hurd，PJ Barnes，et al.Global strategy for asthma management and prevention：GINA executive summary[J].Eur Respir J，2008，31（1）：143-178.

[6] Pavord ID，Pizzichini MM，Pizzichini E，et a1.The use of induced sputum to investigate airway inflammation[J].Thorax，1997，52（6）：498-501.

[7] Thorsen J，Rasmussen MA，Waage J.Infant airway microbiota and topical immune perturbations in the origins of childhood asthma[J].Nature Communications，2019，10（1）：5001.

[8] Kozik A，Huang YJ.Ecological interactions in asthma：From environment to microbiota and immune responses[J].Curr Opin Pulm Med，2020，26（1）：27-32.

[9] 張莉，周敏.微生物群與支氣管哮喘表型關系的研究進展[J].中華結核和呼吸雜志，2016，39（8）：629-632.

[10] Cavaleiro Rufo J，Paciência I，Hoffimann E，et al.The neighbourhood natural environment is associated with asthma in children：A birth cohort study[J].Allergy，2021， 76（1）：348-358.

[11] 曠健，黃榕，劉沉濤.微生物組學在哮喘中的研究進展[J].國際呼吸雜志，2019，39（12）：932-936.

[12] Dinwiddie DL，Denson JL，Kennedy JL.Role of the airway microbiome in respiratory infections and asthma in children[J].Pediatr Allergy Immunol Pulmonol，2018，31（4）：236-240.

[13] Pulvirenti G，Parisi GF，Giallongo A，et al.Lower airway microbiota[J].Front Pediatr，2019，7：393.

[14] Hilty M，Burke C，Pedro H，et al.Disordered microbial communities in asthmatic airways[J].PLoS ONE，2010，5（1）：e8578.

[15] Marri PR，Stern DA，Wright AL，et al.Asthma-associated differences in microbial composition of induced sputum[J].J Allergy Clin Immunol，2019，131（2）：346-352.

[16] Ray A，Kolls JK.Neutrophilic inflammation in asthma and association with disease severity[J].Trends Immunol，2017， 38（12）：942-954.

[17] 張曉巖，林江濤，王文雅，等.35例重癥支氣管哮喘患者臨床特征和氣道炎癥表型[J].中華內科雜志，2019， 58（9）：680-684.

[18] Son JH，Kim JH，Chang HS，et al.Relationship of microbial profile with airway immune response in eosinophilic or neutrophilic inflammation of asthmatics[J].Allergy Asthma Immunol Res，2020，12（3）：412-429.

[19] Taylor SL，Leong LEX，Choo JM，et al.Inflammatory phenotypes in patients with severe asthma are associated with distinct airway microbiology[J].J Allergy Clin Immunol，2018，141（1）：94-103.

[20] Zhang Q，Cox M，Liang Z，et al.Airway microbiota in severe asthma and relationship to asthma severity and phenotypes[J].PLoS One，2016，11（4）：e0152 724.

[21] Ver Heul A，Planer J，Kau AL.The human microbiota and asthma[J].Clin Rev Allergy Immunol，2019，57（3）：350-363.

[22] Lee JJ，Kim SH，Lee MJ，et al.Different upper airway microbiome and their functional genes associated with asthma in young adults and elderly individuals[J].Allergy，2019，74（4）：709-719.

[23] Chiu CY，Chou HC，Chang LC，et al.Integration of metagenomics-metabolomics reveals specific signatures and functions of airway microbiota in mite-sensitized childhood asthma[J].Allergy，2020，75（11）：2846-2857.

（收稿日期：2021-04-06）