司茂飛，鄭國(guó)棟，吳秀杰，張 健＊

(1山東第一醫(yī)科大學(xué)，山東 泰安 271000；2臨沂市人民醫(yī)院)

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)臨床常見，致殘率及死亡率高。有研究表明，細(xì)胞周期調(diào)控參與了腦損傷后的修復(fù)過程。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27通過直接抑制cyclinE/CDK2復(fù)合物負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，阻斷細(xì)胞周期從G1期到S期的進(jìn)程[1]。叉頭盒O (Forkhead box O，F(xiàn)OXO)蛋白是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)亞家族，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和細(xì)胞周期進(jìn)展。FoxO3a是FOXO的一個(gè)亞型，有文獻(xiàn)報(bào)道FoxO3a在乳腺癌、膀胱癌、肝癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤中具有抑制作用[2-3]，其在癌細(xì)胞中的功能缺失會(huì)導(dǎo)致調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展的基因過表達(dá)[4]。本文通過FoxO3a/p27在成年大鼠腦損傷后的變化和功能，探索中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和修復(fù)的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1TBI模型制作[5]取成年雄性S-D大鼠45只，體質(zhì)量200～225 g，按12 h的明暗循環(huán)飼養(yǎng)在無菌環(huán)境，可以自由獲得水和食物。10%水合氯醛溶液深度麻醉大鼠，無菌條件下將一把微刀插入距頭顱正中矢狀線右側(cè)邊3 mm的皮質(zhì)，做一個(gè)長(zhǎng)、深、寬分別為5 mm×3 mm×1 mm的手術(shù)切口，致其腦損傷，然后將切口分層用4-0絲縫線和釘書針縫合，然后將模型鼠置于加熱墊上促其恢復(fù)，共制作成功33例模型，分別于傷后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、28 d處死。另取3只正常大鼠作為對(duì)照組，于3 d時(shí)處死。所有實(shí)驗(yàn)均按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行，該實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)臨沂市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2免疫印跡分析 免疫印跡分析樣本的獲取：取模型鼠傷口周圍的腦組織以及對(duì)側(cè)等份腦組織(70～90 mg)，對(duì)照組大鼠取單側(cè)同等腦組織，并立即在-80℃冷凍備用。將冷凍的腦組織樣本用眼剪刀在冰中切碎后置于裂解緩沖液，勻漿，4號(hào)微離心機(jī)離心20 min澄清。取上清液用BCA法測(cè)定其蛋白濃度后，進(jìn)行sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。將分離的蛋白用轉(zhuǎn)移裝置在300 mA的條件下轉(zhuǎn)移到聚乙烯二氟乙烯膜上(Millipore，德國(guó))，持續(xù)2.5 h，然后用5%脫脂牛奶封膜，用一抗FoxO3a,CDK2,PCNA，p27和GAPDH抗體在4℃環(huán)境中孵育。與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育后，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL，Pierce，USA)對(duì)蛋白進(jìn)行可視化。

1.3免疫組織化學(xué) 從冰箱中取出冷凍腦組織制作切片，在37℃的烤箱中保存30 min，用0.01 M PBS沖洗2次，5 min/次。所有切片均在室溫下用10%驢血清、0.3% Triton X-100和1% BSA封閉2 h，然后用FoxO3a特異性多克隆抗體和p27(Santa Cruz，1∶1000)孵育過夜，然后在生物素化二抗(Vector Laboratories，Burlingame，CA)孵育2 h，用DAB溶液和0.5% H2O2在0.05 M Tris HCl (pH=7.6)中觀察染色。染色后，將切片脫水并覆蓋。用德國(guó)萊卡光學(xué)顯微鏡觀察，染色較濃或中度棕色染色的細(xì)胞計(jì)為陽(yáng)性，未染色的細(xì)胞計(jì)為陰性，染色較淡的細(xì)胞分別計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1免疫印跡實(shí)驗(yàn)情況 對(duì)大鼠腦外傷后12 h～28 d不同時(shí)間點(diǎn)的大腦皮層進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO3a表達(dá)量在創(chuàng)傷后3 d顯著下調(diào)，p27水平在傷后1 d顯著下降，在傷后3 d達(dá)到低谷。FoxO3a表達(dá)與p27表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.902，P=0.002)，見封三圖1。在對(duì)照組中，F(xiàn)oxO3a和p27kip1的表達(dá)無明顯變化。

2.2免疫組化染色情況 FoxO3a染色在損傷3 d后的對(duì)側(cè)大腦中表達(dá)廣泛(見封三圖2 A、C)；而在損傷側(cè)大腦中，F(xiàn)oxO3a染色水平較低(見封三圖2 B、D)。圖2 E為對(duì)照組。此外，免疫組化染色結(jié)果與蛋白印跡結(jié)果基本一致(見封三圖2 F)。

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的病理生理過程，如反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生、氧化自由基生成、線粒體損傷、Ca2+超載、能量代謝障礙和神經(jīng)炎癥激活等，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡和隨后的繼發(fā)性腦組織損傷[6-7]。有研究表明，在腦損傷后修復(fù)過程中，p27表達(dá)降低[8]。FoxO3a已被報(bào)道可以增強(qiáng)許多自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，包括LC-3、Beclin1、ATG12、ATG14、PI3KIII和Ulk2[9]。Sun等人報(bào)道，F(xiàn)oxO3a通過抑制神經(jīng)元自噬，可減輕創(chuàng)傷性腦損傷后的神經(jīng)行為缺陷[10]。FoxO3a和p27極有可能通過調(diào)控細(xì)胞周期參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)過程。

本研究構(gòu)建成年大鼠急性創(chuàng)傷性腦損傷模型，通過免疫印跡分析和免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，損傷后3 d Foxo3a表達(dá)明顯下降，同時(shí)p27表達(dá)水平下調(diào)，二者之間存在明顯的正相關(guān)。提示Foxo3a可能與p27之間存在相互作用。FoxO3a的激活增加了細(xì)胞周期抑制蛋白p27，進(jìn)而抑制G1向S期細(xì)胞周期過渡。FoxO3a是否能促進(jìn)神經(jīng)元存活以及腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。