趙耀　陳培赟　陳會(huì)琴　袁茵　宋浩清　赫明漪　高宇　孔令富　畢保良

摘要：以龍膽草提取物作為添加劑，按照不同比例配制等氮等能飼料，對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行分組飼養(yǎng)。通過(guò)11周養(yǎng)殖試驗(yàn)，采集魚(yú)體肌肉組織，測(cè)定不同添加量組間肌肉常規(guī)及其氨基酸組成等指標(biāo)，以研究龍膽草作為飼料添加劑對(duì)羅非魚(yú)生長(zhǎng)及肌肉品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，龍膽草提取物作為飼料添加劑能夠顯著提升吉富羅非魚(yú)具有提高肌肉粗蛋白含量，增加必需氨基酸以及鮮味氨基酸含量的作用，其中以0.3%為最適添加量。

關(guān)鍵詞：龍膽草;吉富羅非魚(yú);氨基酸;肌肉品質(zhì)

中圖分類(lèi)號(hào)：S963? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

自上世紀(jì)50年代末羅非魚(yú)經(jīng)越南引入國(guó)內(nèi)市場(chǎng)后，便在我國(guó)迅速壯大，截至目前羅非魚(yú)作為我國(guó)具有國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)實(shí)力的品種之一，穩(wěn)居世界首位。近些年來(lái)，隨著高密度養(yǎng)殖以及環(huán)境日益惡化，導(dǎo)致病害頻發(fā)，藥物濫用，造成環(huán)境污染、耐藥菌株等問(wèn)題嚴(yán)重影響羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。而中草藥作為我國(guó)歷史文化中的一塊瑰寶，因其成本低、加工方便、資源豐富、低毒副作用等特性，且同時(shí)具有補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，提高機(jī)體特異性和非特異性免疫的功能而深受人們青睞。其中龍膽草作為龍膽科多年生草本植物，主產(chǎn)于云南、貴州、四川等地，具有保肝、利膽、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗炎等藥理作用[1]，有望作為一種免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用到水產(chǎn)飼料中。本試驗(yàn)在飼料中將龍膽草提取物龍膽苦苷按照一定比例添加，以吉富羅非魚(yú)為研究對(duì)象，探究龍膽草提取物對(duì)肌肉常規(guī)及組份的影響，以期為羅非魚(yú)飼料中添加龍膽苦苷最適添加量提供參考依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)飼料配制

以豆粕、菜粕和魚(yú)粉為主要蛋白源，豆油為脂肪源，配制基礎(chǔ)飼料。在此基礎(chǔ)飼料中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的龍膽苦苷，替代飼料配方中相同質(zhì)量的面粉，配制5種等氮等能飼料。實(shí)驗(yàn)所用龍膽苦苷購(gòu)自陜西朗森生物科技有限公司，含量為5%。試驗(yàn)飼料配方如表1所示。

1.2? 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)所用吉富羅非魚(yú)苗種由西雙版納云博水產(chǎn)養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)有限公司提供，幼魚(yú)平均體重0.5 g。養(yǎng)殖試驗(yàn)在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。試驗(yàn)前對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)用對(duì)照組飼料暫養(yǎng)2周，選擇大小均勻、健康、有活力的羅非魚(yú)，隨機(jī)分入18個(gè)水族箱（6個(gè)試驗(yàn)處理組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40尾魚(yú)）進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)。每天7：00、18：00各投喂1次至飽食狀態(tài)，攝食后2小時(shí)換水1次，換水量為水族箱總體積的1/2，養(yǎng)殖用水均為曝氣24小時(shí)以上的除氯自來(lái)水，水族箱內(nèi)采用內(nèi)循環(huán)流水系統(tǒng)，水體流速10 L/秒，養(yǎng)殖期間采用氣石連續(xù)充氧，水溫保持在29±1℃。飼養(yǎng)周期為11周。

1.3? 樣品采集和保存

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束前對(duì)羅非魚(yú)禁食24小時(shí)，從每個(gè)水族箱中隨機(jī)選取6尾試驗(yàn)魚(yú)，使用MS-222進(jìn)行麻醉，去鱗、去皮后，取其側(cè)線(xiàn)上，背鰭以下的兩側(cè)肌肉，放入無(wú)菌密封袋中，迅速置于液氮中快速冷凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4? 分析測(cè)定

肌肉常規(guī)成分分析參照AOAC法。水分測(cè)定采用冷凍干燥法;粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用凱氏定氮法測(cè)定;粗脂肪的測(cè)定采用索氏提取法（以石油醚為溶劑）測(cè)定;粗灰分的測(cè)定為550℃灼燒法測(cè)定。肌肉組織中氨基酸的測(cè)定采用柱前衍生法，采用日本島津LC-20AT高效液相色譜儀測(cè)定。

營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)價(jià)根據(jù)糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）1973年建議的每克氮氨基酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式和中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院、營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所提出的雞蛋蛋白質(zhì)的氨基酸評(píng)分模式，將所測(cè)得的必需氨基酸含量（占干樣）換算成每克氮中含氨基酸毫克數(shù)（乘以62.5）進(jìn)行比較，氨基酸評(píng)分（AAS）、化學(xué)評(píng)分（CS）和必需氨基酸指數(shù)（EAAI）[2]按以下公式計(jì)算：

（3）式中n為比較的氨基酸數(shù)，aai為待評(píng)蛋白質(zhì)中某一必需氨基酸占必需氨基酸總量百分比，AAi為雞蛋蛋白質(zhì)中該必需氨基酸占必需氨基酸總量百分比。

1.5? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0分析軟件對(duì)樣本進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），當(dāng)處理組之間存在顯著性差異（P<0.05）時(shí)，用Duncan's檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析。所有試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”（means±SEM）表示。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 龍膽草提取物對(duì)吉富羅非魚(yú)肌肉常規(guī)的影響

由表2可見(jiàn)。當(dāng)飼料中添加量達(dá)到0.2%～0.3%時(shí)，魚(yú)體肌肉中的粗蛋白含量顯著高于（P<0.05）對(duì)照組，整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。各組肌肉水分、粗脂肪以及灰分間無(wú)顯著性（P>0.05）差異。

2.2? 龍膽草提取物對(duì)吉富羅非魚(yú)肌肉氨基酸組份的影響

分析結(jié)果如表3所示。飼料中添加龍膽草提取物飼養(yǎng)的吉富羅非魚(yú)肌肉氨基酸組成中，含量最高的前3種氨基酸分別為谷氨酸、天冬氨酸和賴(lài)氨酸，與其他常規(guī)淡水魚(yú)類(lèi)檢測(cè)結(jié)果相同。谷氨酸、蛋氨酸、組氨酸和精氨酸4種氨基酸無(wú)顯著性差異。甘氨酸、脯氨酸和胱氨酸3種氨基酸呈現(xiàn)出總體逐漸上升的趨勢(shì)，0.5%添加量時(shí)達(dá)到最高，含量分別為甘氨酸4.42%、脯氨酸2.81%和胱氨酸0.19%。除此以外，其余氨基酸如：天冬氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸、絲氨酸、酪氨酸，共計(jì)10種氨基酸均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在添加量達(dá)到0.3%時(shí)氨基酸含量達(dá)到最高。在總氨基酸中也得到相同的印證，由表4可知，0.3%添加量時(shí)總氨基酸含量達(dá)到峰值（90.67%）顯著高于對(duì)照組別，對(duì)照組總氨基酸含量（85.59%）均低于添加龍膽草提取物的試驗(yàn)組，說(shuō)明飼料中添加龍膽草提取物對(duì)于吉富羅非魚(yú)的肌肉組份有一定的影響。

2.3.1? 龍膽草提取物對(duì)吉富羅非魚(yú)肌肉鮮味氨基酸組份的影響

魚(yú)肉的鮮美味道主要由天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸4種氨基酸的含量決定。由表4可知，4種鮮味氨基酸中谷氨酸含量最高，其次為天冬氨酸，最后依次為丙氨酸和甘氨酸。天冬氨酸（12.12%）和丙氨酸（5.46%）在0.3%添加量時(shí)含量達(dá)到最大值，而甘氨酸（4.42%）則是在0.5%添加量時(shí)含量達(dá)到峰值。三種具有顯著差異的鮮味氨基酸在對(duì)照組中所含比例均為同試驗(yàn)組最低，分別為天冬氨酸（11.38%）、丙氨酸（5.20%）、甘氨酸（4.05%）。證明龍膽草提取物的適量添加對(duì)于吉富羅非魚(yú)鮮味氨基酸的提升具有一定作用。同樣鮮味氨基酸的總和顯示在0.3%添加量時(shí)鮮味氨基酸的總量為（38.99%）顯著高于對(duì)照組。

2.3.2? 龍膽草提取物對(duì)吉富羅非魚(yú)肌肉必需氨基酸組份的影響

吉富羅非魚(yú)經(jīng)不同添加量的龍膽草提取物飼料投喂后肌肉中必需氨基酸的含量見(jiàn)表5。如表所示，必需氨基酸總和在0.3%時(shí)（32.73%）顯著高于對(duì)照組（31.08%）。其中由于色氨酸遭鹽水水解破壞，故無(wú)色氨酸含量。在已測(cè)知的七種必需氨基酸中，含量最高的是賴(lài)氨酸，其次為亮氨酸、纈氨酸以及蘇氨酸。蛋氨酸在各組間無(wú)顯著性差異外，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸4種必需氨基酸均在0.3%添加量時(shí)達(dá)到最大值，顯著高于對(duì)照組。亮氨酸、賴(lài)氨酸以及蘇氨酸在0.4%添加量時(shí)顯著低于0.3%添加量。

2.4? 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)定

食品蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在很大程度上取決于其所含必需氨基酸的含量與組成比例。根據(jù)表6所示，以AAS為指標(biāo)分析，吉富羅非魚(yú)的第一限制性氨基酸為蛋氨酸+胱氨酸，第二限制性氨基酸為纈氨酸;以CS為指標(biāo)分析，吉富羅非魚(yú)的第一限制性氨基酸為蛋氨酸+胱氨酸，第二限制性氨基酸則為苯丙氨酸+酪氨酸，可以看出不論以何種模式評(píng)價(jià)，不同龍膽草提取物添加量的試驗(yàn)組與對(duì)照組限制性氨基酸相同，蛋氨酸+胱氨酸均為羅非魚(yú)的第一限制性氨基酸。以雞蛋蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)試驗(yàn)羅非魚(yú)肌肉進(jìn)行必需氨基酸指數(shù)（EEAI）計(jì)算，0.3%添加量評(píng)分最高最48.13，對(duì)照組評(píng)分最低為45.66。

3? 討論

從肌肉常規(guī)方面來(lái)講，學(xué)界現(xiàn)普遍認(rèn)為，當(dāng)魚(yú)肉中的水分含量較高時(shí)，相應(yīng)的肌肉中蛋白和脂肪含量會(huì)降低，其肌肉品質(zhì)就差;相反，當(dāng)魚(yú)肉中的水分含量較低時(shí)，其蛋白和脂肪含量就會(huì)升高，在食用口感上表現(xiàn)為肌肉品質(zhì)提升，魚(yú)肉更加細(xì)嫩[3]。中草藥的主要有效成分一般包括植物多糖、生物堿、有機(jī)酸以及苷類(lèi)等，尤其中草藥所含的三萜皂甙成分，能明顯提升養(yǎng)殖動(dòng)物肌肉中的肌苷酸含量和肌肉的抗氧化性能，降低膽固醇含量，從而有效改善養(yǎng)殖動(dòng)物的肌肉品質(zhì)。本試驗(yàn)中所采用龍膽草提取物的活性成分主要為龍膽苦甙，屬裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物[4]。羅慶華等[5]在鯉魚(yú)飼料中加入2%、4%、6%的杜仲葉粉發(fā)現(xiàn)，杜仲葉粉可顯著提升鯉魚(yú)肌肉中粗蛋白含量，以及降低肌肉中粗脂肪的含量，但對(duì)水分、粗灰分無(wú)顯著影響。同樣通過(guò)在飼料中添加不同濃度的杜仲提取物、大蒜素和二者配伍的復(fù)方飼養(yǎng)草魚(yú)，證明該提取物可顯著提升草魚(yú)肌肉中的蛋白質(zhì)含量，降低脂肪含量[6]。這與本試驗(yàn)龍膽草提取物顯著提升羅非魚(yú)肌肉中粗蛋白的結(jié)果相似，但在本試驗(yàn)中粗脂肪未見(jiàn)顯著差異，可能與飼養(yǎng)周期過(guò)短，魚(yú)體脂肪沉積緩慢或受魚(yú)種影響的緣故，粗脂肪未表現(xiàn)出顯著差異性。馬國(guó)紅[7]將4種復(fù)方中草藥以3‰的添加量添加在飼料中用于投喂鯉魚(yú)，研究表明，與對(duì)照組相比較，試驗(yàn)所用的各復(fù)方中草藥不同程度的提高了鯉魚(yú)粗蛋白含量，且具有降低飼料系數(shù)的效果，但無(wú)顯著性差異性。而在由黃芪、黃柏等組成的復(fù)方2中，鯉魚(yú)肉體中氨基酸含量顯著高于對(duì)照組。但在邱小琮[8]的研究中表明，在飼料中添加2%山楂、麥芽等粉碎按比例制成復(fù)方中草藥，投喂異育銀鯽僅僅能夠顯著提升異育銀鯽肌肉中脂肪含量，而對(duì)魚(yú)肉中水分、蛋白質(zhì)、各類(lèi)脂肪酸、水解和游離氨基酸的含量均無(wú)顯著變化，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和呈味氨基酸的含量也無(wú)顯著影響。

當(dāng)今社會(huì)隨著人們生活質(zhì)量的提高，飲食習(xí)慣也逐漸由吃得飽向吃得好轉(zhuǎn)變。而魚(yú)肉作為世界公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)蛋白源，必不可少的成為人們飲食中關(guān)注的焦點(diǎn)。眾所周知，蛋白是由氨基酸脫水縮合形成的，而呈味氨基酸作為氨基酸中的一類(lèi)，主要包括天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸等，肌肉中呈味氨基酸含量的多少，直接影響著肉品品質(zhì)。孟曉林、冷向軍[9-10]等在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在飼料中添加4%、6%杜仲粉投喂鯉魚(yú)，不僅可以使鯉魚(yú)肌肉的鮮味氨基酸含量顯著升高，而且飼養(yǎng)鯉魚(yú)的背部肌纖維變細(xì)、腹部肌細(xì)胞直徑減小，魚(yú)肉品質(zhì)得到極大的改善。同樣張耀武[11]等人用黃芩、茯苓、板藍(lán)根等多種中草藥組成的復(fù)方中，通過(guò)與飼料混合飼養(yǎng)黃河鯉魚(yú)，試驗(yàn)結(jié)果表明隨著添加量的提升，該復(fù)方中草藥對(duì)黃河鯉魚(yú)肌肉中必需氨基酸和鮮味氨基酸總量比值均有顯著提升。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在商品飼料中添加3%的龍膽草提取物，能顯著提高吉富羅非魚(yú)肌肉中鮮味氨基酸以及必需氨基酸含量，與上述作者結(jié)果相近。

因此，根據(jù)羅非魚(yú)飼料中添加龍膽草提取物對(duì)羅非魚(yú)肌肉品質(zhì)的影響試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，建議最適添加量為0.3%，即4000 mg/kg為宜。

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基金項(xiàng)目：云南省農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)研究聯(lián)合專(zhuān)項(xiàng)（2017G001-021），云南省土著魚(yú)科技小院專(zhuān)項(xiàng)，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)第十三屆學(xué)生科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)行動(dòng)基金項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：趙耀（1995-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖及營(yíng)養(yǎng)生理。E-mail：2687169863@qq.com

通信作者：畢保良（1977-），男，副教授，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖及水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與生理研究。E-mail：1448151770@qq.com