閆瀠心　李裕強　張夢茹　裴若怡　吳玉妹

摘要：為了篩選出中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）低溫下顯著上調(diào)表達的基因，揭示中國明對蝦耐低溫分子調(diào)控機制。利用DEseq2方法對3種類型中國明對蝦常溫和低溫轉(zhuǎn)錄組進行差異表達基因（differential expression genes，DEG）檢測，篩選出6條低溫下顯著上調(diào)表達的抗凋亡與免疫相關(guān)類基因。并運用生物信息學(xué)的分析方法，分析這些基因的表達產(chǎn)物，功能性狀，以及低溫上調(diào)表達的原因。研究結(jié)果顯示，6條中國明對蝦低溫上調(diào)表達基因的編碼產(chǎn)物包括：發(fā)揮分子伴侶作用的HSP70、HSP20、DEAD-box RNA解旋酶，發(fā)揮抗凋亡作用的Pim-1激酶和富甘氨酸蛋白以及發(fā)揮免疫作用的絲氨酸蛋白酶。本研究篩選并鑒定了中國明對蝦耐低溫相關(guān)基因，揭示了其耐低溫脅迫下分子調(diào)控機制，以期為中國明對蝦耐低溫品系育種工作的改良提供參考。

關(guān)鍵詞：中國明對蝦;耐低溫性狀;分子伴侶;抗凋亡;免疫力

中圖分類號：S968.2? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A

中國明對蝦是我國重要的水產(chǎn)資源，溫度是影響其生長發(fā)育的重要因素，4℃～38℃為中國明對蝦的水溫耐受范圍，最佳生長溫度為25℃，且放苗溫度不可低于14℃[1]。對低溫的不耐受導(dǎo)致中國明對蝦冬季的養(yǎng)殖工作艱難，成活率下降，養(yǎng)殖成本大幅上升，最終影響了經(jīng)濟效益。因此，對中華明對蝦耐低溫相關(guān)基因進行研究，選育出耐低溫且生長速度較快的優(yōu)良新品種，對中國明對蝦的資源保護十分重要。國內(nèi)外對于水產(chǎn)動物耐低溫相關(guān)基因的研究已有很多，如：孟憲紅等[1]人利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序篩選出中國明對蝦的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等5條低溫上調(diào)表達基因，并利用RT-PCR技術(shù)驗證其研究結(jié)果。但是目前有關(guān)中國明對蝦抗寒基因的研究還不夠全面，許多耐低溫相關(guān)因子及其基因還未被注釋。本研究分析了低溫誘導(dǎo)下野生和選育中華明對蝦的轉(zhuǎn)錄組序列，從中篩選出其中在6個以上比較組中重復(fù)出現(xiàn)，上調(diào)差異表達且表達量FPKM≥100的基因。本文對其中發(fā)揮分子伴侶，抗凋亡和提高免疫作用的基因進行了生物信息學(xué)分析并注釋，為揭示中國明對蝦的抗寒分子調(diào)控機制提供更多基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，從而為中國明對蝦低溫育種提供了更多分子層面的理論支持。

1? 材料與方法

1.1? 材料

中國明對蝦選育組來源于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所海水養(yǎng)殖遺傳育種中心即墨鰲山衛(wèi)實驗基地（緯度：36°20′32.22″N，經(jīng)度：120°39′1.93″E），28℃恒溫水域養(yǎng)殖，隨機選取35尾G15代（共94個家系）的仔蝦。野生組以渤海海域捕撈的野生中國明對蝦為親蝦，于山東大學(xué)（威海）養(yǎng)殖中心（緯度：37°31′42.96″N，經(jīng)度：122°3′52.74″E）人工培育蝦苗（水溫18℃），隨機選取35尾。

1.2? 方法

1.2.1? 取樣

分別選取野生和選育的中國明對蝦幼蝦進行低溫誘導(dǎo)，與常溫組進行比對，對比較組中中國明對蝦樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序。

樣本包括：10日齡野生常溫幼蝦（P10YC）、10日齡野生低溫誘導(dǎo)幼蝦（P10YD）、40日齡選育常溫幼蝦（P40XC）、40日齡選育低溫誘導(dǎo)幼蝦（P40XD）、40日齡野生常溫幼蝦（P40YC）、40日齡野生低溫誘導(dǎo)幼蝦（P40YD）。

1.2.2? 差異表達基因/轉(zhuǎn)錄本篩選

根據(jù)DEseq2方法進行差異表達基因檢測。定義差異倍數(shù)為兩倍以上并且矯正后的p-value≤0.001的基因，篩選為顯著差異表達基因。

進一步篩選出其中上調(diào)差異表達并且表達量FPKM≥100的基因。最終共在以下9個常、低溫比較組中，篩選出32個符合上述條件的基因。

在這32個基因中，共有23個基因在6個比較組之間共同存在，即在6個比較組中都顯著上調(diào)差異表達，本文對其中發(fā)揮分子伴侶，抗凋亡和提高免疫作用的6條基因進行生物信息學(xué)分析，包括：CL975.Contig1_All、CL4921.Contig1_All、CL234.Contig15_All、CL804.Contig4_All、Unigene472_All、Unigene5751_All

1.2.3? 生物信息學(xué)分析

利用GenBank數(shù)據(jù)庫中的blast程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進行基因序列比對，找尋相似度高的序列。

利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）進行氨基酸序列的相似性比對，找尋基因所編碼的蛋白質(zhì)。

利用ORF氨基酸序列檢索數(shù)據(jù)庫Pfam（http：//pfam.xfam.org/）、ORFfinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析蛋白結(jié)構(gòu)域。

經(jīng)過以上的檢索工作，仍有部分序列無法獲取其產(chǎn)物信息，此時利用PSIPRED Workbench（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/），對上述操作中獲得的ORF序列所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行預(yù)測。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 分子伴侶相關(guān)基因

2.1.1? CL975.Contig1_All

轉(zhuǎn)錄本CL975.Contig1_All長2714nt，與Genbank數(shù)據(jù)庫已知注釋中國明對蝦 HSP70 mRNA（FJ167398.1）序列有82.21%一致度。Pfam分析表明，234-2162區(qū)段的ORF與HSP70結(jié)構(gòu)域（PF00012）呈現(xiàn)顯著的相似性。由此，判斷CL975.Contig1_All 編碼中國明對蝦的 HSP70 （Heart shock protein 70）。

2.1.2? Unigene5751_All

轉(zhuǎn)錄本Unigene5751_All長1076nt。Pfam分析表明，935-132的ORF與HSP20家族結(jié)構(gòu)域（PF00011）呈現(xiàn)非顯著相似。Interpro分析表明ORF13的130-255區(qū)段編碼含有267個氨基酸的HSP20-like_chaperone（IPR008978）。

基于以上信息，判斷Unigene5751_All可能編碼中國明對蝦的HSP20 （Heart shock protein 20）。

2.1.3? CL234.Contig15_All

轉(zhuǎn)錄本CL234.Contig15_All長2138nt，與GenBank數(shù)據(jù)庫已知注釋南美白對蝦DEAD-box RNA解旋酶基因（KT122790.1）序列有97.01%一致度。Pfam分析表明，134-1690區(qū)段的ORF與DEAD/DEAH box解旋酶結(jié)構(gòu)域（PF00270）呈現(xiàn)顯著的相似性。由此，判斷CL234.Contig15_All 編碼中國明對蝦的DEAD-box RNA解旋酶（DEAD-box RNA helicases）。

2.2? 抗凋亡相關(guān)基因

2.2.1? CL804.Contig4_All

轉(zhuǎn)錄本CL804.Contig4_All長1746 nt，與GenBank 數(shù)據(jù)庫已知注釋南美白對蝦絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pim-1基因（KY386849.1）序列有96.65%一致度。Pfam分析表明，1624-521區(qū)段的ORF與蛋白激酶結(jié)構(gòu)域（PF00069）呈現(xiàn)顯著的相似性，已知Pim-1激酶含有此結(jié)構(gòu)域[2]。由此，判斷CL804.Contig4_All 編碼中國明對蝦的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pim-1蛋白（Pim-1 proto-oncogene， serine/threonine kinase）。

2.2.2? CL4921.Contig1_All

轉(zhuǎn)錄本CL4921.Contig1_All長814nt。Pfam分析表明，18-329區(qū)段的ORF與富甘氨酸蛋白結(jié)構(gòu)域（PF07172）有非顯著相似性。結(jié)合PSIPRED預(yù)測，分析其編碼產(chǎn)物為一種跨膜蛋白，結(jié)合核酸或受體發(fā)揮作用，推測其可能是富甘氨酸蛋白（Glycine rich protein，GRP）基因表達產(chǎn)物。

2.3? 免疫相關(guān)基因

2.3.1? Unigene472_All

轉(zhuǎn)錄本Unigene472_All長1411nt，與Genbank數(shù)據(jù)庫已知注釋中國明對蝦絲氨酸蛋白酶有93.83%的一致度。Pfam分析表明，43-1227區(qū)段的ORF與絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域（PF18322）呈現(xiàn)顯著的相似性。由此，判斷Unigene472_All編碼中國明對蝦的絲氨酸蛋白酶（serine protease）。

3? 討論

溫度是影響中國明對蝦生長發(fā)育的重要因素，因此，找尋與中國明對蝦耐低溫性狀相關(guān)的基因，并通過分子育種技術(shù)實現(xiàn)耐低溫新品種的高效選育具有重要意義。

本研究分析了低溫誘導(dǎo)下野生和選育中華明對蝦的轉(zhuǎn)錄組序列，篩選出其中在6個以上比較組中重復(fù)出現(xiàn)，上調(diào)差異表達且表達量FPKM≥100的基因，其編碼產(chǎn)物包括：發(fā)揮分子伴侶作用的HSP70、HSP20和DEAD-box RNA解旋酶，發(fā)揮抗凋亡作用的HSP70、Pim-1激酶和富甘氨酸蛋白，以及發(fā)揮提高免疫作用的絲氨酸蛋白酶。

3.1? 分子伴侶相關(guān)基因

3.1.1? HSP70

轉(zhuǎn)錄本CL975.Contig1_All經(jīng)鑒定編碼HSP70。

熱休克蛋白是一類機體在應(yīng)急狀況下產(chǎn)生的保護性蛋白，在水生動物適應(yīng)逆境脅迫中起著重要的作用[3]。HSP70屬于熱休克蛋白家族中的重要成員，其分子量約為70kD。

經(jīng)分析，在中國明對蝦耐低溫脅迫方面，HSP70主要從三個方面發(fā)揮其分子伴侶功能，其中最主要的是幫助新合成肽鏈的折疊：在ATP的協(xié)助下，HSP70可以與未折疊肽鏈的疏水區(qū)結(jié)合，防止其在低溫下發(fā)生折疊錯誤或聚集，以維持蛋白質(zhì)分子的正確構(gòu)型。次要功能包括：在低溫脅迫下幫助蛋白質(zhì)跨膜運輸和修復(fù)受損的蛋白質(zhì)，從而維持細胞在低溫下的生理活性[4]。

3.1.2? HSP20

轉(zhuǎn)錄本Unigene5751_All經(jīng)鑒定編碼HSP20。

HSP20屬于小分子熱休克蛋白家族（smHSP family），是普遍存在且保守性最差的熱休克蛋白家族。

經(jīng)分析，HSP20在中國明對蝦適應(yīng)低溫脅迫中主要起到：以分子伴侶的形式維持細胞蛋白穩(wěn)定，進而維持細胞的正常生理狀態(tài)，具體機制如下：

作為分子伴侶以維持低溫脅迫下蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定時，HSP20的作用方式不同于其它熱休克蛋白，其可以不依賴ATP直接行使功能[5]。它的作用方式類似于蛋白酶，通過與未折疊蛋白表明的疏水基團結(jié)合，防止其在低溫脅迫下發(fā)生不可逆的聚合，還可溶解異常蛋白，維持低溫下蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能[6]。

3.1.3? DEAD-box RNA解旋酶

轉(zhuǎn)錄本CL234.Contig15_All經(jīng)鑒定編碼DEAD-box RNA解旋酶。

DEAD-box RNA解旋酶是一種由水解ATP功能催化RNA解旋的解旋酶，是參與生物冷適應(yīng)的RNA伴侶，其具體作用機制如下：

mRNA構(gòu)象對溫度敏感，低溫脅迫下，容易形成構(gòu)象錯誤的二級結(jié)構(gòu)使細胞中的翻譯活動受阻。DEAD-box RNA解旋酶可以解旋這些構(gòu)象錯誤的mRNA二級結(jié)構(gòu)，并協(xié)助其形成正確的構(gòu)象，確保寒冷條件下翻譯活動仍能順利進行[7]。此外，DEAD-box RNA解旋酶基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄翻譯的途徑還包括通過自身磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子并調(diào)節(jié)下游低溫效應(yīng)基因的表達，是生物體內(nèi)重要的抗低溫脅迫調(diào)控因子[8]。

3.2? 抗凋亡相關(guān)基因

3.2.1? HSP70

除分子伴侶作用，HSP70還可在中國明對蝦耐低溫脅迫中發(fā)揮抗凋亡作用。

HSP70抗細胞凋亡機制主要為抑制應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase， SAPK）的活性。SPKA是啟動細胞凋亡程序的必需蛋白，想要觸發(fā)細胞凋亡，就必須激活SAPK信號傳導(dǎo)通路。寒冷脅迫下，HSP70可以通過阻斷信號通路，抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的SAPK激活或抑制其活性，從而抑制細胞凋亡[9]。

3.2.2? 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pim-1蛋白

轉(zhuǎn)錄本CL804.Contig4_All經(jīng)鑒定編碼Pim-1激酶。

Pim-1基因是一種高度保守的原癌基因，作用于凋亡過程的負調(diào)控。Pim-1激酶可以調(diào)控腫瘤細胞的增殖、代謝、凋亡等多個方面。

通過分析，Pim-1基因在中國明對蝦適應(yīng)低溫脅迫中上調(diào)表達的具體機制為：當(dāng)細胞接受到外界的冷刺激后，Pim-1激酶可以使一些調(diào)控第二信使的蛋白發(fā)生磷酸化，之后由第二信使把信息傳遞給蛋白激酶，蛋白激酶再通過催化多種功能蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，從而調(diào)節(jié)細胞的多種生命活動以適應(yīng)冷脅迫[10]，進而阻止或減少冷脅迫所導(dǎo)致的中國明對蝦細胞凋亡，進一步提高了中國明對蝦對低溫環(huán)境的適應(yīng)能力，使其在寒冷環(huán)境中的存活率提高。

目前，有關(guān)Pim-1的研究主要集中在癌癥治療方面，因此，有關(guān)中國明對蝦Pim-1基因低溫上調(diào)表達和Pim-1酶活性提高的原因還有待于進一步研究。

3.2.3? 富甘氨酸蛋白

轉(zhuǎn)錄本CL4921.Contig1_All經(jīng)分析可能編碼富甘氨酸蛋白。

富甘氨酸蛋白是一種由甘氨酸高度重復(fù)序列組成的蛋白質(zhì)[11]，受冷脅迫調(diào)節(jié)，在生物對低溫的響應(yīng)與適應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。目前，諸多關(guān)于GRP基因的研究主要集中在植物抵抗環(huán)境脅迫方面，如：李景艷等[12]利用qRT-PCR技術(shù)，檢測GRP7基因在不同逆境脅迫、不同組織中的表達情況，得出鹽芥GRP7基因在寒冷等逆境脅迫下會上調(diào)表達的結(jié)論。

經(jīng)分析，推測GRP基因在中國明對蝦適應(yīng)環(huán)境脅迫中可能起到了抗細胞凋亡作用，但相關(guān)機制還未有報道，還需進一步深入探究。

3.3? 免疫相關(guān)基因-絲氨酸蛋白酶

轉(zhuǎn)錄本Unigene472_All經(jīng)鑒定編碼絲氨酸蛋白酶。

絲氨酸蛋白酶是一種重要的水解酶，其以絲氨酸為活性中心，在各種生物體內(nèi)廣泛存在。絲氨酸蛋白酶及其同源物在無脊椎動物的先天免疫中發(fā)揮作用，具體作用方式包括：合成抗菌多肽和黑色素，促進淋巴凝血和細胞黏附等[13]。

通過分析，推測中國明對蝦絲氨酸蛋白酶基因低溫上調(diào)表達的原因可能為：絲氨酸蛋白酶通過參與絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)加強對蝦免疫力，在增強中國明對蝦適應(yīng)免疫中發(fā)揮重要作用。

4? 結(jié)論

（1）本研究所篩選的6條基因在低溫脅迫下顯著上調(diào)表達，表明這6條基因與中國明對蝦的耐低溫性狀有關(guān)。

（2）在中國明對蝦抗低溫脅迫中：CL975.Contig1_All編碼的HSP70、Unigene5751_All編碼的HSP20和CL234.Contig15_All編碼的DEAD-box RNA解旋酶發(fā)揮分子伴侶作用，CL975.Contig1_All編碼的HSP70、CL804.Contig4_All編碼的Pim-1激酶和CL4921.Contig1_All編碼的富甘氨酸蛋白發(fā)揮抗凋亡作用，Unigene472_All編碼的絲氨酸蛋白酶發(fā)揮提高免疫作用。

（3）本研究豐富了中國明對蝦的耐低溫相關(guān)因子及基因，為其低溫品系育種提供了更多分子層面的理論支持。但目前有關(guān)中國明對蝦的耐低溫基因篩選還不夠全面，還有許多抗寒基因和耐低溫分子機制等待科研者的探究。

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作者簡介：閆瀠心（2001-），女，漢族，山東淄博人，山東大學(xué)在讀本科生，研究方向：海洋藥物工程。

通信作者：李裕強（1969-），男，漢族，甘肅靜寧人，農(nóng)學(xué)博士，山東大學(xué)副教授，研究方向：細胞生物學(xué)。