丁小　趙云龍　李艷嬌　喬淑芬　許夢(mèng)瑤　苗婷婷

摘要：為探索花鰍對(duì)溫度的急性應(yīng)激反應(yīng)，采用8℃、12℃、16℃和20℃脅迫長(zhǎng)期養(yǎng)殖于12±2℃的溫度條件下的花鰍12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)，觀察行為、成活率，超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和丙二醛指標(biāo)。結(jié)果顯示，4個(gè)溫度梯度下，成活率均為100%，行為發(fā)生變化，溫度越高活動(dòng)性越強(qiáng)，20℃開(kāi)始出現(xiàn)在水體中上層頻繁游動(dòng)現(xiàn)象。同一溫度處理，除12℃處理組，超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性和丙二醛含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，不同時(shí)間存在顯著差異;同一檢測(cè)時(shí)間，三者均隨溫度升高呈先下降后上升的趨勢(shì)，除48小時(shí)的不同溫度超氧化物歧化酶活性之間無(wú)顯著差異，其余不同溫度均存在顯著差異。水溫發(fā)生急劇變化，影響魚(yú)體行為，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，應(yīng)密切關(guān)注養(yǎng)殖水溫的變化，減少溫度應(yīng)激，增加花鰍免疫力，提高抗病能力。

關(guān)鍵詞：花鰍;溫度;超氧化物歧化酶;過(guò)氧化氫酶;丙二醛

中圖分類號(hào)：Q955? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

花鰍（Cobitis taenia）屬鰍科動(dòng)物，是多年生小型經(jīng)濟(jì)冷水魚(yú)，也是一味中藥材，長(zhǎng)白山區(qū)冷水域有分布，對(duì)水體環(huán)境要求極高，生活在清澈的砂石底溪水或河流中[1]，明顯不同于常見(jiàn)泥鰍。魚(yú)類在進(jìn)化過(guò)程中對(duì)外界剌激形成了應(yīng)激反應(yīng)。如果刺激超出了魚(yú)類正常的調(diào)控范圍，則會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生危害。受養(yǎng)殖環(huán)境約束，當(dāng)魚(yú)無(wú)法逃避又不能克服這些有害刺激時(shí)，對(duì)魚(yú)的危害就更加突出。因?yàn)閼?yīng)激能力會(huì)使魚(yú)類重新分配體內(nèi)能量，以應(yīng)對(duì)眼前危機(jī)，進(jìn)而將不可避免地削弱生長(zhǎng)、繁殖和免疫等方面的機(jī)能，即為應(yīng)激付出一定的生物學(xué)代價(jià)[2]。本文從溫度刺激方面入手，探究花鰍應(yīng)激反應(yīng)，并尋找緩解其應(yīng)激的措施，以期為花鰍及其他長(zhǎng)白山區(qū)冷水魚(yú)的人工馴養(yǎng)和繁殖等活動(dòng)提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)，同時(shí)豐富魚(yú)類應(yīng)激生物學(xué)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在通化師范學(xué)院長(zhǎng)白山區(qū)冷水魚(yú)類分子進(jìn)化與健康養(yǎng)殖試驗(yàn)室進(jìn)行，材料于2020年06月初取自通化育華農(nóng)林科技發(fā)展有限責(zé)任公司。共計(jì)450條外觀無(wú)異常、健康、初始重量為8.71±0.50 g、體長(zhǎng)為101.74±1.70 mm的花鰍作為研究對(duì)象，置于養(yǎng)殖水族箱（聚乙烯塑料，長(zhǎng)寬高分別為1.5 m、1.0 m、0.8 m），飼養(yǎng)條件為水溫12±1℃，pH值7.0～7.5，溶解氧含量大于5.0 mg/L，氨氮含量小于0.01 mg/L，硫化物小于0.05 mg/L，穩(wěn)定飼養(yǎng)2周后，開(kāi)始試驗(yàn)。試驗(yàn)期間，每天準(zhǔn)確稱取一定量的飼料，依據(jù)每日殘餌量調(diào)整次日投喂量，投喂后1小時(shí)，將殘餌用虹吸管吸出。投喂時(shí)間分別為每天早、晚6：00。養(yǎng)殖用水先經(jīng)曝氣，每周換水1次。

1.2? 試驗(yàn)方法與操作步驟

試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)溫度處理組（8℃、12℃、16℃和20℃），每個(gè)溫度設(shè)置3個(gè)重復(fù)組，采用自動(dòng)控溫設(shè)備控制溫度。試驗(yàn)開(kāi)始隨機(jī)取30尾放入設(shè)定溫度的水族箱中，在0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每箱隨機(jī)取樣5尾魚(yú)，試驗(yàn)期間不飼喂。

1.3? 樣品采集及測(cè)定

取5尾魚(yú)后解剖取肝胰臟，用吸水紙將肝胰臟擦干，精準(zhǔn)稱取組織，冰浴條件下，按體積（mL）∶質(zhì)量（g）=9∶1的比例加入生理鹽水，使用玻璃研磨器磨碎后裝進(jìn)離心管，2500 r/min，4℃條件下，離心10 min取上清液檢測(cè)。超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒，購(gòu)自南京建成生物研究所，操作按照說(shuō)明書執(zhí)行。

1.4? 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan法進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 急性溫度脅迫對(duì)花鰍生存和行為影響

如表1所示，所選擇的4個(gè)溫度3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，花鰍成活率均為100%，無(wú)死亡，行為發(fā)生了變化，雖都會(huì)在底層聚集，但溫度越低活動(dòng)性減弱，溫度越高活動(dòng)性加強(qiáng)，20℃開(kāi)始出現(xiàn)在中上層頻繁游動(dòng)現(xiàn)象。

2.2? 急性溫度脅迫對(duì)花鰍肝胰臟SOD和CAT活性的影響

如圖1所示，同一溫度處理，SOD活性隨時(shí)間延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，除12℃，不同時(shí)間SOD活性之間存在顯著差異（P<0.05）;同一檢測(cè)時(shí)間，除起始0小時(shí)，SOD活性隨溫度升高呈先下降后上升的趨勢(shì)，12小時(shí)和24小時(shí)的不同溫度SOD活性之間存在顯著差異（P<0.05），48小時(shí)的不同溫度SOD活性之間無(wú)顯著差異。

如圖2所示，同一溫度處理，CAT活性隨時(shí)間延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，除12℃，不同時(shí)間CAT活性之間存在顯著差異（P<0.05）;同一檢測(cè)時(shí)間，除起始0小時(shí)，CAT活性隨溫度升高呈先下降后上升的趨勢(shì)，不同溫度CAT活性之間存在顯著差異（P<0.05）。

2.3? 急性溫度脅迫對(duì)花鰍肝胰臟MDA含量的影響

如圖3所示，同一溫度處理，除12℃，MDA含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，不同時(shí)間MDA含量之間存在顯著差異（P<0.05）;同一檢測(cè)時(shí)間，除起始0小時(shí)，MDA含量均隨溫度升高呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，不同溫度MDA含量之間存在顯著差異（P<0.05）。

3? 討論

溫度是影響動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的因素之一。急性溫度變化是魚(yú)類在養(yǎng)殖生產(chǎn)、商品運(yùn)輸甚至自然生活過(guò)程中可能遭遇到的最常見(jiàn)脅迫，可造成機(jī)體代謝紊亂，使體內(nèi)自由基大量積累，進(jìn)而損害細(xì)胞和組織正常的生理機(jī)能和免疫防御能力[3]。魚(yú)類會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)代謝、離子平衡以應(yīng)對(duì)溫度變化，保持相對(duì)穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，減少自身受到傷害。魚(yú)類具有認(rèn)知或感知能力[4]，行為變化是遭受刺激后最直接、快速的反應(yīng)[5]。與生理指標(biāo)的檢測(cè)方法相比，具有簡(jiǎn)易、便捷、實(shí)用等優(yōu)勢(shì)。由試驗(yàn)可知，在急性溫度脅迫下，成活率雖均為100%（表1），但20℃開(kāi)始出現(xiàn)中上層頻繁游動(dòng)現(xiàn)象。由此可見(jiàn)，相對(duì)高溫急性脅迫，花鰍對(duì)于低溫脅迫適應(yīng)能力要更強(qiáng)一些，這也進(jìn)一步證實(shí)了花鰍屬于典型的冷水魚(yú)。

水溫急劇變化，魚(yú)類會(huì)通過(guò)連續(xù)的生化反應(yīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)自身的代謝水平來(lái)適應(yīng)。細(xì)胞水平上最常見(jiàn)是氧化應(yīng)激反應(yīng)，以酶抗氧化系統(tǒng)[6]（如SOD、CAT等）和過(guò)氧化脂質(zhì)及其產(chǎn)物MDA[7，8]等作為量化指標(biāo)。溫度脅迫花鰍時(shí)，氧化還原產(chǎn)生活性氧自由基，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧代謝失衡，不及時(shí)清理，就會(huì)造成機(jī)體活性氧傷害[9]。SOD和CAT是生物體內(nèi)2種相互關(guān)聯(lián)的抗氧化酶，可聯(lián)合清除活性氧自由基，免受氧化傷害，體內(nèi)SOD和CAT的酶活力下降，標(biāo)志著機(jī)體清除自由基的能力下降。檢測(cè)SOD和CAT的動(dòng)態(tài)變化，可以準(zhǔn)確地反映機(jī)體內(nèi)自由基的代謝及組織的氧化損傷情況，對(duì)判斷健康狀況及免疫防御能力具有重要的參考價(jià)值[10]。本研究中，花鰍遇到溫度脅迫后，SOD酶活性迅速升高，用于清除體內(nèi)的活性氧自由基等。雖然CAT活性變化的幅度與SOD相差不大，但CAT活性的變化有明顯的滯后性，直至24小時(shí)時(shí)才達(dá)到最大值，而此時(shí)SOD已呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明花鰍的SOD酶活性較CAT更易受環(huán)境因子的影響。

MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物，產(chǎn)生會(huì)加劇膜的損傷。在機(jī)體衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo)[11]。MDA產(chǎn)生量的多少能夠代表膜脂過(guò)氧化的程度，也可間接反映組織的抗氧化能力的強(qiáng)弱。一般來(lái)說(shuō)，MDA含量越高，生物體所受的壓力越大。半滑舌鰨在低溫脅迫6小時(shí)后，MDA就會(huì)明顯的升高[12]。本研究中，MDA含量從脅迫12小時(shí)開(kāi)始就有升高的現(xiàn)象，至24小時(shí)達(dá)到最高值，48小時(shí)后即出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。這一變化規(guī)律與溫度脅迫凡納濱對(duì)蝦[13]和福壽螺[14]的MDA含量變化結(jié)果類似。表明溫度刺激后，魚(yú)體代謝加快，脂質(zhì)過(guò)氧化程度增強(qiáng)，通過(guò)一段時(shí)間調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶活性，可以使體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度降低，適應(yīng)溫度變化。

取樣期正好是花鰍的繁殖季節(jié)，水溫可能發(fā)生急劇變化，影響機(jī)體細(xì)胞和組織正常的生理機(jī)能和免疫能力。由于機(jī)體各層次的代謝水平和生理狀況都發(fā)生了相應(yīng)變化，不同因子間是相互貫通、相互依存、不可分割，共同維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，進(jìn)而會(huì)對(duì)處于繁殖期的親魚(yú)產(chǎn)生影響，影響種群的補(bǔ)充。在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，對(duì)于進(jìn)入生殖期的雌魚(yú)，更應(yīng)密切關(guān)注養(yǎng)殖水溫的變化，減少溫度應(yīng)激，增加魚(yú)體免疫力，提高抗病能力。

參考文獻(xiàn)

[1]富國(guó)棟，高文由. 長(zhǎng)白山西南坡野生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物志[M]. 吉林：通化地區(qū)農(nóng)業(yè)區(qū)劃委員會(huì)辦公室，1985，39.

[2]Moberg G， Mench J. The Biology of Animal Stress： Basic Principles and Implications for Animal Welfare[M]. New York： CABI，2000，1-377.

[3]Orbea A， Ortiz-Zarragoitia M， Solé M et al. Antioxidant enzymes and peroxisome proliferation in relation to contaminant body burdens of PAHs and PCBs in bivalve molluscs， crabs and fish from the Urdaibai and Plentzia estuaries （Bay of Biscay）[J]. Aquatic Toxicology，2002，58（1）：75-98.

[4]Volpato G. Challenges in assessing fish welfare[J]. ILAR J，2009，50（4）：329-337.

[5]Brown C， Laland K， Krause J. Fish Cognition and Behavior[M]. 2011，1-450.

[6]Pandey S， Parvez S， Sayeed I， et al. Biomarkers of oxidative stress： a comparative study of river Yamuna fish Wallago attu （Bl. & Schn.）[J]. The Science of the Total Environment，2003，309（1-3）：105-115.

[7]Morales AE， Pérez-Jiménez A， Hidalgo MC et al. Oxidative stress and antioxidant defenses after prolonged starvation in Dentex dentex liver[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C Toxicology & Pharmacology，2004，139（1-3）：153-161.

[8]Prieto AI， Pichardo S， Jos á et al. Time-dependent oxidative stress responses after acute exposure to toxic cyanobacterial cells containing microcystins in tilapia fish （Oreochromis niloticus） under laboratory conditions[J]. Aquatic Toxicology，2007，84（3）：337-345.

[9]王偉，姜志強(qiáng)，孟凡平，等. 急性溫度脅迫對(duì)太平洋鱈仔稚魚(yú)成活率、生理生化指標(biāo)的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2012，31（8）：463-466.

[10]洪美玲，陳立僑，顧順樟，等. 不同溫度脅迫方式對(duì)中華絨螯蟹免疫化學(xué)指標(biāo)的影響[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2007，13（6）：818-822.

[11]Lepage G， Munoz G， Champagne J， et al. Preparative steps necessary for the accurate measurement of malondialdehyde by high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry，1991，197（2）：277-283.

[12]孫學(xué)亮，邢克智，陳成勛，等.急性溫度脅迫對(duì)半滑舌鰨血液指標(biāo)的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2010，29（7）：387-392.

[13]Xu Z， Regenstein J M， Xie D， et al. The oxidative stress and antioxidant responses of Litopenaeus vannamei to low temperature and air exposure. Fish & Shellfish Immunology，2018，72：564–571.

[14]陳煉，鄔婷，陳燏，等. 溫度對(duì)福壽螺抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志，2019，54（5）：727-735.

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20190301050NY）;通化師范學(xué)院校級(jí)項(xiàng)目（CS2020092）。

作者簡(jiǎn)介：丁?。?001-），女，山東莒縣人，本科，生物科學(xué)專業(yè)。

通信作者：趙云龍（1983-），男，北京人，博士研究生，研究方向：動(dòng)物資源研究與利用。E-mail：252268020@qq.com