王 琪胡佳亮張金良郭 寧吳 飛 林 曉*康興東*馮 怡

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,上海 201203;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心,上海 201203;3.江西普正制藥股份有限公司,江西 吉安 343100)

薄荷為唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部分,具有疏散風(fēng)熱、清利頭目等作用；荊芥穗為唇形科植物荊芥 Schizonepeta tenuisfolia Briq.的干燥花穗,具有解表散風(fēng)、透疹等作用,在辛涼解表制劑中常將兩者混合后提取揮發(fā)油,是發(fā)揮相關(guān)療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。其中,薄荷揮發(fā)油主要成分為薄荷腦、L-薄荷酮,而荊芥穗揮發(fā)油主要由胡薄荷酮、L-薄荷酮等成分組成。

大多數(shù)揮發(fā)油具有不穩(wěn)定、易揮發(fā)、刺激性強(qiáng)等特點(diǎn),為了提高該成分在液體制劑中的穩(wěn)定性,常采用β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精對其進(jìn)行處理[2-3]。本實(shí)驗(yàn)制備了薄荷-荊芥穗揮發(fā)油羥丙基-β-環(huán)糊精包合物,并優(yōu)化了其包合工藝[4],以期為該制劑研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 XP205 型電子分析天平(0.01 mg,瑞士Mettler-Toledo 公司)；FA2104N 型電子分析天平(0.1 mg,上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Labconco 12 Plus Free Zone 型冷凍干燥機(jī)(美國Labconco 公司)；SHJ-6AB 型磁力攪拌水浴鍋(常州金壇良友儀器有限公司)；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；TGL-18C 型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Aglient 7890A型氣相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；UPR-I-10T 型純化水制備儀(成都超純科技有限公司)；玻璃儀器(上海青陽生物科技有限公司)。

1.2 試劑與藥物 薄荷腦(批號110728-201707,純度99.8%)、L-薄荷酮(批號111705-201105,純度99.8%)、胡薄荷酮(批號111706-201606,純度99.8%) 對照品(中國食品藥品檢定研究院)；羥丙基-β-環(huán)糊精(批號180101,淄博千匯生物科技有限公司)。薄荷-荊芥穗揮發(fā)油(批號190304,薄荷腦、L-薄荷酮、胡薄荷酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為38%、18%、17%,江西普正制藥股份有限公司)。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 包合物制備 參考文獻(xiàn)[5-7]報(bào)道。精密稱取一定量羥丙基-β-環(huán)糊精,加適量水,在60 ℃下溶解后冷卻至所需溫度,吸取少量揮發(fā)油,無水乙醇稀釋后緩慢滴到羥丙基-β-環(huán)糊精溶液中,恒溫下磁力攪拌一定時(shí)間,冷凍干燥,少量乙酸乙酯洗滌,40 ℃下烘干,即得。

2.2 揮發(fā)油含有量測定

2.2.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)[8]報(bào)道。HP-5 型高效毛細(xì)管色譜柱(0.32 mm×30 m,0.25 μm)；載氣N2,體積流量1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫,60 ℃下保持1 min,3 ℃/min 升至126 ℃,26 ℃/min 升至230 ℃,保持2 min；FID檢測器溫度280 ℃；進(jìn)樣量0.20 μL,不分流進(jìn)樣。色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取薄荷腦、L-薄荷酮、胡薄荷酮對照品適量,置于量瓶中,甲醇溶解稀釋,即得(0.10 mg/mL,3 種成分質(zhì)量濃度分別為0.100 2、0.102 3、0.098 6 mg/mL)。

圖1 各成分GC 色譜圖Fig.1 GC chromatograms of various constituents

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取干燥包合物200 mg,置于錐形瓶中,加入50 mL 乙醇,稱定質(zhì)量,超聲處理20 min,放冷,乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,12 000 r/min 離心10 min,取上清液,即得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系考察 分別取對照品薄荷腦50.20 mg、L-薄荷酮51.25 mg、胡薄荷酮49.40 mg,置于5 mL 量瓶中,甲醇定容至刻度,分別制成10.00 mg/mL 溶液,甲醇依次稀釋至5.00、2.50、1.00、0.10、0.05、0.01 mg/mL,各精密吸取0.2 μL,在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸,得薄荷腦、L-薄荷酮、胡薄荷酮方程分別為Y=9 398.4X-86.048 (r=0.999 6)、Y=9 138.9X-93.553 (r=0.999 6)、Y=8 038.8X-73.495(r=0.999 6),分別在0.01～10.04、0.01～10.25、0.01～9.88 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2” 項(xiàng)下對照品溶液適量,在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次,每次0.2 μL,測得薄荷腦、L-薄荷酮、胡薄荷酮峰面積RSD 分別為1.75%、1.86%、1.79%,表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.3” 項(xiàng)下同一份供試品溶液適量,于0、2、4、6、8、12 h在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣0.2 μL 測定,測得薄荷腦、L-薄荷酮、胡薄荷酮峰面積RSD 分別為1.76%,1.81%、1.82%,表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取6 份包合物,每份約200 mg,按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣0.2 μL 測定,測得薄荷腦、L-薄荷酮、胡薄荷酮峰面積RSD 分別為1.68%、1.28%、1.48%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3 包合率、含油率、收率測定 指標(biāo)性成分薄荷腦-L-薄荷酮-胡薄合酮(1∶1∶1) 包合譯價(jià)的計(jì)算公式分別為包合率=包合物實(shí)際含油量/揮發(fā)油加入量×100%、含油率=包合物實(shí)際含油量/包合物質(zhì)量×100%、收率=[包合物質(zhì)量/ (羥丙基-β-環(huán)糊精加入量+揮發(fā)油加入量) ]×100%[9]。

2.4 綜合評分計(jì)算 以包合率 (Y1)、含油率(Y2)、收率(Y3) 的綜合評分為評價(jià)指標(biāo)[10],采用G1主觀賦權(quán)法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理[11-12],上述3 種指標(biāo)分別賦予權(quán)重系數(shù)0.5、0.3、0.2[13],計(jì)算綜合評分(Y),公式為Y=(Y1/Y1max) ×0.5+(Y2/Y2max) ×0.3+(Y3/Y3max) ×0.2。

2.5 單因素試驗(yàn) 查閱文獻(xiàn)[14-16],本實(shí)驗(yàn)選擇羥丙基-β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例、羥丙基-β-環(huán)糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)、包合溫度、包合時(shí)間、攪拌速度作為影響因素,因素水平見表1,結(jié)果見圖2～6。由此可知,羥丙基-β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例對包合效果有顯著影響(P＜0.05),最優(yōu)工藝暫定為羥丙基-β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例12∶1,羥丙基-β-環(huán)糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%,包合溫度40 ℃,包合時(shí)間1.5 h,攪拌速度600 r/min。

表1 單因素試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels for single factor tests

2.6 Box-Behnken 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇羥丙基-β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例(A)、羥丙基-β-環(huán)糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、包合溫度(C) 作為影響因素,含油率、包合率、收率的綜合評分(Y) 作為評價(jià)指標(biāo),Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化包合工藝[17]。因素水平見表2,結(jié)果見表3。

圖2 羥丙基-β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例對綜合評分的影響Fig.2 Effect of （hydroxypropyl-β-cyclodextrin） -volatile oils ratio on comprehensive score

圖3 羥丙基-β-環(huán)糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)對綜合評分的影響Fig.3 Effect of hydroxypropyl-β-cyclodextrin mass fraction on comprehensive score

圖4 包合溫度對綜合評分的影響Fig.4 Effect of inclusion temperature on comprehensive score

圖5 包合時(shí)間對綜合評分的影響Fig.5 Effect of inclusion time on comprehensive score

通過Design-Expert 8.0.6 軟件對表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行二項(xiàng)式擬合,得到方程為Y=81.24+10.99A-19.43A2(r=0.835 6),方差分析見表4。由此可知,模型P＜0.05,失擬項(xiàng)P＞0.05,表明模型擬合度良好；各因素影響程度依次為A＞B＞C,其中A有顯著影響(P＜0.05),而B、C 無顯著影響(P＞0.05)。

圖6 攪拌速度對綜合評分的影響Fig.6 Effect of stirring speed on comprehensive score

表2 Box-Behnken 響應(yīng)面法因素水平Tab.2 Factors and levels for Box-Behnken response surface method

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of tests

通過Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析,結(jié)果見圖7～10。由此可知,在試驗(yàn)參數(shù)范圍內(nèi)隨著羥丙基-β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例增加,含油率逐漸降低,包合率逐漸升高,收率有升高趨勢但不如包合率明顯,最終達(dá)到相對穩(wěn)定的水平。最終確定,最優(yōu)工藝為羥丙基-β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例11∶1,羥丙基-β-環(huán)糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)43%,包合溫度47 ℃,包合時(shí)間1.5 h,攪拌速度600 r/min,綜合評分為83.24,同時(shí)為便于工業(yè)化生產(chǎn),將羥丙基-β-環(huán)糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)修正為40%。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

再按照優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果見表5,可知綜合評分平均值82.33 與預(yù)測值83.24 接近,表明該工藝穩(wěn)定可行。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.5 Results of verification tests （n=3）

3 討論

圖7 各因素對含油率的影響Fig.7 Effects of various factors on oil content

圖8 各因素對包合率的影響Fig.8 Effects of various factors on encapsulation efficiency

圖9 各因素對收率的影響Fig.9 Effects of various factors on yield

圖10 各因素對綜合評分的影響Fig.10 Effects of various factors on comprehensive score

Box-Behnken 響應(yīng)面法的優(yōu)勢在于通過建立多項(xiàng)式回歸模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,能探究2 個(gè)因素之間交互關(guān)系對結(jié)果的影響,進(jìn)一步補(bǔ)足單因素試驗(yàn)缺陷,從而更為準(zhǔn)確地預(yù)測最優(yōu)方案[18],并且該方法突破了均勻設(shè)計(jì)、正交設(shè)計(jì)受線性模型限制的缺陷,具有試驗(yàn)次數(shù)少、預(yù)測準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)[19]。因此,本實(shí)驗(yàn)采用該方法優(yōu)化薄荷-荊芥穗揮發(fā)油羥丙基-β-環(huán)糊精包合物制備工藝,得到最優(yōu)條件為羥丙基-β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例11∶1,羥丙基-β-環(huán)糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%,包合溫度47 ℃,包合時(shí)間1.5 h,攪拌速度600 r/min,驗(yàn)證試驗(yàn)顯示該工藝穩(wěn)定可行。

采用環(huán)糊精包合技術(shù)對揮發(fā)油進(jìn)行包合后,能有效提高后者在液體制劑中的穩(wěn)定性、溶解度,而且操作簡便可行,安全性高,但該方法受客體分子結(jié)構(gòu)的影響較大,易造成包合前后揮發(fā)油成分發(fā)生變化[20-21]。因此,本實(shí)驗(yàn)又同時(shí)測定了薄荷-荊芥穗揮發(fā)油中薄荷腦、L-薄荷酮、胡薄荷酮3 個(gè)指標(biāo)成分的含有量,并以揮發(fā)油包合率、包合物含油率、收率的綜合評分為評價(jià)指標(biāo),以期篩選最佳包合工藝[22]。

另外,環(huán)糊精包合揮發(fā)油后自組裝效應(yīng)會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng),可能導(dǎo)致中藥液體制劑出現(xiàn)沉淀、澄明度變化等問題[23],從而影響其質(zhì)量。因此,在包合過程中應(yīng)適當(dāng)降低環(huán)糊精的用量。