李雙雙李 希 鄧 謙施崇精馮建安黃 嫣王 玉

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,四川 成都 611137;2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所,四川 成都 610031)

椒香溫中止痛方是由花椒、延胡索、香附等藥材組成的中藥復(fù)方,具有溫中散寒、行氣止痛的功效,臨床上主要用于治療脾胃虛寒引起的脘腹冷痛。方中花椒性溫味辛,具有溫中止痛、殺蟲止癢作用,以及抗腫瘤、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌等藥理活性[1-5],揮發(fā)油是其主要藥效成分,可殺蟲、抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、促進(jìn)皮膚滲透等[6-8],能有效抑制冰醋酸引起的疼痛反應(yīng)[9-10]；香附功效疏肝解郁、理氣寬中、調(diào)經(jīng)止痛,其揮發(fā)油具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗抑郁等作用[11-12],這2 種揮發(fā)油均為全方鎮(zhèn)痛的主要藥效成分,但它們對空氣和溫度敏感,易氧化,在放置、貯存過程中易揮發(fā)損失。因此,本實(shí)驗(yàn)將優(yōu)化椒香溫中止痛方揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合工藝[13-14],再對包合物進(jìn)行表征,以期增加該成分的穩(wěn)定性。

1 材料

KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋、DZTW 型調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；JB-3型定時恒溫磁力攪拌器(上海雷磁新涇儀器有限公司)；GZX-9070MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；BT-125D 型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(中國) 有限公司]；D8 Advance X 射線衍射儀、VERTEX 70V 型傅立葉變換紅外光譜儀(德國布魯克光譜儀器公司)。β-環(huán)糊精(陜西禮泉化工有限實(shí)業(yè)公司)。花椒(批號190116,產(chǎn)地四川)、香附(批號181117,產(chǎn)地廣西) 均購于四川省中藥飲片有限責(zé)任公司,經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所謝守德主任中藥師鑒定為正品,符合2020 年版《中國藥典》 要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取 根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果,按照2020 年版 《中國藥典》 四部揮發(fā)油測定法(甲法) 提取。稱取處方量花椒、香附共300 g,置于5 000 mL 圓底燒瓶中,加10 倍量水,加熱至沸騰后保持微沸狀態(tài)6 h,靜置30 min,收集揮發(fā)油。

2.2 包合工藝研究

2.2.1 空白回收率測定 精密吸取花椒、香附混合揮發(fā)油1 mL,置于500 mL 圓底燒瓶中,加入300 mL 蒸餾水,連接揮發(fā)油提取器,水蒸氣蒸餾法提取約6 h 至油量不再增加,冷卻1 h 后讀取揮發(fā)油體積,平行3 次,取平均值,計(jì)算空白回收率,公式為空白回收率=揮發(fā)油體積/揮發(fā)油加入量×100%。結(jié)果,空白回收率為90%。

2.2.2 包合方法考察 目前,常用的揮發(fā)油包合方法主要有飽和水溶液法、研磨法、超聲法[15-16]。本實(shí)驗(yàn)采用以上3 種方法制備包合物,并測定包合率、收率,公式分別為包合率=[包合物中揮發(fā)油量/ (揮發(fā)油加入量×空白回收率) ]×100%、收率=[包合物質(zhì)量/ (β-環(huán)糊精加入量+揮發(fā)油加入量) ]×100%。

2.2.2.1 飽和水溶液法 稱取20 g β-環(huán)糊精至500 mL 燒杯中,平行3 份,按照8%比例加入一定量水,加熱使β-環(huán)糊精充分溶解。另取2 mL 混合揮發(fā)油,按1∶1 比例加入無水乙醇,混合均勻后加到冷卻至40 ℃的β-環(huán)糊精飽和溶液中(邊加邊攪拌),在恒溫磁力攪拌器下繼續(xù)攪拌2 h,冷卻至室溫后置于4 ℃冰箱里中冷卻24 h,抽濾,殘?jiān)靡颐严礈? 次,每次15 mL,置于40 ℃真空干燥箱中干燥4 h,稱定質(zhì)量,即得包合物。將包合物置于500 mL 圓底燒瓶中,加入300 mL 蒸餾水,水蒸氣蒸餾法提取約6 h 至提取器中油量不再增加,冷卻1 h 后讀取揮發(fā)油體積,平行3 次,測定包合率、收率,結(jié)果見表1。

2.2.2.2 研磨法 稱取20 g β-環(huán)糊精至500 mL燒杯中,平行3 份,按照8% 比例加入一定量水,加熱使β-環(huán)糊精充分溶解,當(dāng)溫度降至40 ℃時加入揮發(fā)油,置于乳缽中研磨2 h,研磨液置于4 ℃冰箱中冷卻24 h,抽濾,殘?jiān)脽o水乙醚洗滌3次,每次15 mL,置于40 ℃真空干燥箱中干燥4 h,稱定質(zhì)量,即得包合物。將包合物置于500 mL 圓底燒瓶中,加入300 mL 蒸餾水,水蒸氣蒸餾法提取約6 h 至提取器中油量不再增加,冷卻1 h 后讀取揮發(fā)油體積,平行3 次,測定包合率、收率,結(jié)果見表1。

2.2.2.3 超聲法 稱取20 g β-環(huán)糊精至500 mL燒杯中,平行3 份,按照8% 比例加入一定量水,加熱使β-環(huán)糊精充分溶解,當(dāng)溫度降至40 ℃時加入揮發(fā)油,40 ℃、120 Hz 下超聲處理2 h,置于4 ℃冰箱中冷卻24 h,抽濾,殘?jiān)靡颐严礈? 次,每次15 mL,置于40 ℃真空干燥箱中干燥4 h,稱定質(zhì)量,即得包合物。將包合物置于500 mL圓底燒瓶中,加入300 mL 蒸餾水,水蒸氣蒸餾法提取約6 h 至提取器中油量不再增加,冷卻1 h 后讀取揮發(fā)油體積,平行3 次,測定包合率、收率,結(jié)果見表1。

表1 3 種包合方法的比較（n=3）Tab.1 Comparison of three inclusion methods （n=3）

2.2.2.4 結(jié)果分析 飽和水溶液法所包合揮發(fā)油的平均包合率、收率均較高,其原因可能是研磨法容易破壞β-環(huán)糊精結(jié)構(gòu),研磨過程中溫度逐漸降低,而超聲法容易將包合后的揮發(fā)油重新萃取出來。另外,飽和水溶液法平均包合率、收率的RSD 均小于5%,表明該方法重復(fù)性良好,故本實(shí)驗(yàn)以其對揮發(fā)油進(jìn)行包合。

2.3 Box-Behnken 響應(yīng)面法

2.3.1 評價(jià)指標(biāo)組合賦權(quán)

2.3.1.1 G1 法主觀賦權(quán) G1 法是專家主觀認(rèn)為各評價(jià)指標(biāo)的重要程度賦予相應(yīng)權(quán)重,是對AHP法的進(jìn)一步改進(jìn),無需一致性檢驗(yàn)。具體步驟為①確定評價(jià)指標(biāo)的序關(guān)系,包合率是衡量包合效果的重要指標(biāo),故將其作為主要篩選指標(biāo)；收率在大生產(chǎn)過程中也很有意義,在β-環(huán)糊精、揮發(fā)油投入量一定的情況下其數(shù)值越高,包合效果越好,故可作為次要篩選指標(biāo)[17],上述2 項(xiàng)指標(biāo)的重要程度依次為包合率(y1) ＞收率(y2)；②專家給出相鄰指標(biāo)Xk-1與Xk重要性程度之比rk的理想賦值,結(jié)合課題組其他專家意見,確定上述2 項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重評價(jià)度為r2=1.6；③計(jì)算第m 個指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)Wm,公式為wm= (1 +)-1,其中wk-1=rkwk,k=m,m - 1,…,2。另外,wzj 為評價(jià)指標(biāo)G1 法權(quán)重構(gòu)成的向量(j=1,2,…,m),即= (w1,w2,…,wm)

2.3.1.2 熵權(quán)法客觀賦權(quán) 熵權(quán)法是將各項(xiàng)指標(biāo)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化處理后,根據(jù)所得信息熵值來判斷它們在綜合評價(jià)中的重要性,指標(biāo)信息熵越小,所提供的信息量越大,其在綜合評價(jià)中所占權(quán)重就越大[18]。具體步驟為①原始數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理,Yij= (xij- min{xij})/(max{xij} -min{xij}) ；②標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)的歸一化處理,fij=；③求出各指標(biāo)的信息熵,④ 確定各指標(biāo)權(quán)重,wsj= (1 -Ei)/(m -)(j=1,2,…,m)。

2.3.1.3 組合權(quán)重計(jì)算 公式為wj=。

2.3.2 因素水平 通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及查閱文獻(xiàn)[19-21],選擇攪拌時間 (A)、包合溫度 (B)、β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例(C) 作為影響因素,包合率(X)、收率(Y) 作為評價(jià)指標(biāo),計(jì)算綜合評分(Z),公式為Z=0.608 0Xi/Xmax+0.392 0Yi/Ymax,設(shè)計(jì)3 因素3 水平、17 個試驗(yàn)點(diǎn),因素水平見表2,各指標(biāo)組合權(quán)重見表3。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

表3 各指標(biāo)組合權(quán)重Tab.3 Combined weights of various indices

2.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 按照表2 因素水平加入一定量β-環(huán)糊精,并加適量蒸餾水加熱攪拌制成飽和溶液,每次均加入混合揮發(fā)油與無水乙醇按1∶1 比例組成的混合液2 mL,在磁力攪拌機(jī)上保持相應(yīng)溫度攪拌至規(guī)定時間,冷卻至室溫后置于4 ℃冰箱中24 h,取出,抽濾,殘?jiān)脽o水乙醚洗滌3 次,每次15 mL,置于40 ℃真空干燥箱中干燥4 h,測定包合率、收率,結(jié)果見表4。

2.3.4 方差分析 通過Design Expert 10.0 軟件對表4 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到方程為Z=-112.998+24.678 75A+5.139 5B+18.369 38C-0.362AB-0.011 25AC -0.045BC -2.846 25A2-0.053 887B2-0.909 06C2,方差分析見表5。由此可知,R2=0.973 4,表明模型擬合程度良好,可用于分析預(yù)測；模型P＜0.01,失擬項(xiàng)P＞0.05,表明模型可靠；各因素影響程度依次為C＞B＞A。

2.3.5 響應(yīng)面分析 通過Design Expert 10.0 軟件進(jìn)行分析,結(jié)果見圖1。由此確定,最優(yōu)工藝為攪拌時間1.94 h,包合溫度37.34 ℃,β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例9.17∶1,綜合評分91.12,考慮到實(shí)際操作情況,將其修正為攪拌時間2 h,包合溫度37 ℃,β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例9∶1。

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.4 Design and results of tests

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

2.3.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)“2.3.5” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn),測得綜合評分分別為90.42、90.11、89.74,平均90.09,與預(yù)測值91.12 相近,表明該工藝穩(wěn)定可行。

2.4 包合物表征

2.4.1 顯微法 取包合物、β-環(huán)糊精少許,制成水裝片后置于載玻片上,顯微鏡在40 倍目鏡下進(jìn)行觀察并拍照,結(jié)果見圖2。由此可知,β-環(huán)糊精為規(guī)則的板狀結(jié)晶,而與揮發(fā)油包合后形成不規(guī)則黑色狀物,表明其物相可能發(fā)生改變。

2.4.2 TLC 法 稱取包合物0.5 g,置于10 mL 量瓶中,無水乙醇定容至刻度,超聲提取15 min,濾過,取上清液,作為溶液A；稱取β-環(huán)糊精0.5 g,置于10 mL 量瓶中,無水乙醇定容至刻度,超聲提取15 min,濾過,取上清液,作為溶液B；稱取適量包合物,水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油,精密量取0.2 mL,置于10 mL 量瓶中,無水乙醇定容至刻度,搖勻,作為溶液C；精密量取未經(jīng)包合的揮發(fā)油0.2 mL,置于10 mL 量瓶中,無水乙醇定容至刻度,搖勻,作為溶液D。取上述4 種溶液各5 μL,點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上,以正己烷-乙酸乙酯(4∶1) 為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%香草醛濃硫酸溶液顯色,105 ℃下烘干至斑點(diǎn)清晰,結(jié)果見圖3。由此可知,包合物、β-環(huán)糊精中未見明顯斑點(diǎn),而包合物提取的揮發(fā)油斑點(diǎn)與未經(jīng)包合的揮發(fā)油幾乎一致,表明包合前后揮發(fā)油主要成分無明顯變化。

2.4.3 傅里葉變換紅外光譜(FTIR) 取揮發(fā)油、β-環(huán)糊精、物理混合物、包合物適量,與溴化鉀混合均勻后壓片,在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描,結(jié)果見圖4。由此可知,β-環(huán)糊精中γ-OH 發(fā)生明顯的位移,由包合前的3 379.63 cm-1移至包合后的3 391.25 cm-1,而且其締合氫鍵寬峰在包合后變窄,表明主客體之間形成了大量氫鍵,提示存在分子間包合[22]；包合后揮發(fā)油在1 724.37、1 448.44 cm-1等處的吸收峰已消失或明顯減弱,而物理混合物仍然存在,表明其紅外振動受到了影響,包合物制備成功。

圖1 各因素響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots for various factors

圖2 樣品顯微圖（×40）Fig.2 Microscopic images for samples （×40）

2.4.4 X 射線衍射(XRD) 取β-環(huán)糊精、物理混合物、包合物適量,設(shè)定條件為Cu 靶；電壓40 kV；電流40 mA；掃描方式步進(jìn)掃描,步寬0.02°；掃描范圍(2θ) 3°～40°；停留時間0.1 s,結(jié)果見圖5。由此可知,物理混合物衍射峰呈現(xiàn)混合揮發(fā)油與β-環(huán)糊精疊加的特征；包合物圖譜不是揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的簡單疊加,在4°～8°處衍射峰消失,并出現(xiàn)新的特征峰,在15°～20°、20°～25°處出現(xiàn)新的衍射峰,或峰發(fā)生裂分,在25°～40°處特征峰減弱或消失,表明包合物制備成功。

3 討論

圖4 樣品FTIR 圖Fig.4 FTIR spectra for samples

圖5 樣品XRD 圖Fig.5 XRD patterns for samples

前期查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),目前大多數(shù)關(guān)于包合工藝的研究還是停留在正交設(shè)計(jì)階段,但該方法只能進(jìn)行線性數(shù)學(xué)模型擬合,確定單因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,具有精度不高、預(yù)測性不佳等缺點(diǎn)；響應(yīng)面法可通過Design Expert 10.0 軟件求得高精度的回歸方程,利用其進(jìn)行合理預(yù)測來得到最優(yōu)工藝,并能直觀反應(yīng)各交互因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[23-24]。因此,本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化椒香溫中止痛方揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合工藝。

揮發(fā)油是花椒主要成分之一,具有揮發(fā)性強(qiáng)、穩(wěn)定性差等問題,在貯存過程中易損失；α-香附酮是香附揮發(fā)油主要藥效成分,功效理氣止痛,與椒香溫中止痛方治療腹痛的作用相符,但該成分屬于雙環(huán)倍半萜類化合物,對空氣、光、酸性物質(zhì)等較敏感,不夠穩(wěn)定。為了保證椒香溫中止痛方藥效,并防止方中揮發(fā)油在貯存過程中發(fā)生氧化變質(zhì)而造成損失,本實(shí)驗(yàn)采用β-環(huán)糊精對其進(jìn)行包合以提高穩(wěn)定性。

本實(shí)驗(yàn)以揮發(fā)油包合率、包合物收率為評價(jià)指標(biāo),采用主客觀綜合賦權(quán)的方法確定兩者權(quán)重系數(shù),既減少了賦值的不確定性,又增加了處方中各指標(biāo)之間的內(nèi)在聯(lián)系。最終確定,最優(yōu)包合工藝為β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例9∶1,包合溫度37 ℃,攪拌時間2 h,驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行,而且表征試驗(yàn)結(jié)果顯示包合物已成功形成,有利于椒香溫中止痛方藥效成分的控制和相關(guān)制劑工藝的改進(jìn)。