何 敏,陳瀟瀟,陳 燕*,李佳佳

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院藥學(xué)部,江蘇 南京 210009;2.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210009)

表虛感冒顆粒由桂枝、白芍、葛根、炒苦杏仁、生姜、大棗6 味藥材組成,可用于發(fā)熱惡風(fēng)、有汗、頭痛項(xiàng)強(qiáng)、咳嗽痰白、鼻鳴干嘔、苔薄白、脈浮緩等感冒風(fēng)寒表虛證的治療[1],該制劑收載于2015 年版《中國(guó)藥典》 一部[1],但僅以臣藥白芍所含芍藥苷為檢測(cè)指標(biāo),而文獻(xiàn)[2-4]也僅對(duì)其單一成分進(jìn)行定量分析。中藥及其制劑有效成分繁多復(fù)雜,藥理作用相輔相承,單一成分難以有效控制其質(zhì)量穩(wěn)定性和療效一致性,故多指標(biāo)成分測(cè)定已成為相關(guān)質(zhì)量評(píng)價(jià)的發(fā)展趨勢(shì)。

按照中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則[5],本實(shí)驗(yàn)選取質(zhì)量穩(wěn)定、價(jià)廉易得的葛根素作為內(nèi)標(biāo),采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定表虛感冒顆粒中君藥桂枝主要藥效成分肉桂酸、桂皮醛,臣藥白芍主要活性成分氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷,佐藥葛根特征性成分3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷的含有量,以期建立該制劑多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式,并為提高相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 型高效液相色譜儀(美國(guó)沃特斯公司)；Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；FA2004 型電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；SB25-12DT 型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試劑與藥物 染料木苷 (批號(hào)111709-201702,純度99.9%)、肉桂酸 (批號(hào)110786-201604,純度98.8%)、桂皮醛 (批號(hào)110710-201821,純度99.6%)、芍藥苷 (批號(hào)110736-201943,純度95.1%)、葛根素 (批號(hào)110752-201816,純度95.4%) 對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；氧化芍藥苷(批號(hào)18031641,純度98.8%)、芍藥內(nèi)酯苷(批號(hào)18040323,純度98.5%)、3′-羥基葛根素 (批號(hào)17051825,純度100.0%)、3′-甲氧基葛根素(批號(hào)17032021,純度99.7%) 對(duì)照品均購(gòu)于上海同田生物技術(shù)股份有限公司。表虛感冒顆粒 (每袋裝10 g,批號(hào)20190142、20190602、20200102) 來源于遼寧華潤(rùn)本溪三藥有限公司。乙腈為色譜純(德國(guó)Merck公司)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A) -0.1%甲酸(B),梯度洗脫(0～9.0 min,15.0%A；9.0～20.0 min,15.0%～23.0% A；20.0～35.0 min,23.0%～34.0% A；35.0～45.0 min,34.0%～40.0% A；45.0～50.0 min,40.0%～15.0%A)；體積流量0.9 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm (0～20.0 min,氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷)[6-7]、250 nm (20.0～35.0 min,3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷)[8-10]、280 nm (35.0～50.0 min,肉桂酸、桂皮醛)[11]；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷、肉桂酸、桂皮醛對(duì)照品適量,50% 乙醇制成質(zhì)量濃度分別為0.408、1.712、2.998、1.214、3.856、0.992、0.218、0.172、1.954 mg/mL 的貯備液,分別精密吸取1.0 mL,50%乙醇定容至20 mL,即得(各成分質(zhì)量濃度分別為20.4、85.6、149.9、60.7、192.8、49.6、10.9、8.6、97.7 μg/mL)。

2.3 供試品溶液制備 取顆粒適量,研細(xì),取粉末約2.0 g,精密稱定,精密加入50%乙醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理30 min,放冷,50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按照顆粒制備工藝和處方比例,分別制備缺白芍、缺葛根、缺桂枝的陰性樣品,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備,即得。

2.5 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見圖1。由此可知,各成分色譜峰峰形對(duì)稱,分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)按各成分計(jì)均不小于4 500,陰性無(wú)干擾,表明該方法專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL,50% 乙醇定容至20 mL,制成對(duì)照品溶液Ⅰ～Ⅵ,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,結(jié)果見表1,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次,測(cè)得氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷、肉桂酸、桂皮醛峰面積RSD 分別為1.05%、0.91%、0.61%、0.96%、0.57%、1.01%、1.10%、1.23%、0.68%,表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液,分別于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷、肉桂酸、桂皮醛峰面積RSD 分別為1.01%、0.92%、0.58%、0.99%、0.63%、0.98%、1.07%、1.25%、0.71%,表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批顆粒,按“2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷、肉桂酸、桂皮醛含有量RSD分別為1.34%、1.27%、0.95%、1.25%、0.84%、1.52%、1.78%、1.86%、0.99%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含有量已知的同一批顆粒9 份,研細(xì),每份取約1.0 g,精密稱定,按照2020 年版《中國(guó)藥典》 四部要求精密加入對(duì)照品溶液 (各成分質(zhì)量濃度分別為氧化芍藥苷0.212 mg/mL、芍藥內(nèi)酯苷0.976 mg/mL、芍藥苷2.154 mg/mL、3′-羥基葛根素0.816 mg/mL、葛根素2.852 mg/mL、3′-甲氧基葛根素0.718 mg/mL、染料木苷0.126 mg/mL、肉桂酸0.094 mg/mL、桂皮醛1.142 mg/mL) 0.5、1.0、1.5 mL 各3 份,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果,氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷、肉桂酸、桂皮醛平均加樣回收率(RSD) 分別為98.39%(1.20%)、100.01% (0.81%)、99.56% (0.78%)、99.73% (1.02%)、100.08% (0.75%)、97.99%(1.39%)、97.62% (1.54%)、96.98% (1.13%)、98.97% (0.95%)。

2.11 相對(duì)校正因子測(cè)定 精密吸取“2.6” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液Ⅰ～Ⅵ,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,以葛根素為內(nèi)標(biāo),計(jì)算其他8 種成分的相對(duì)校正因子fk/s,公式為fk/s= fk/fs=(CkAs)/(CsAk),其中Ck為其他成分含有量,Ak為其他成分峰面積,Cs為內(nèi)標(biāo)含有量,As為內(nèi)標(biāo)峰面積,結(jié)果見表2。

2.12 耐用性試驗(yàn)

2.12.1 儀器、色譜柱 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,考察Waters 2695、Agilent 1200 型色譜儀及Agilent ZORBAX SB-C18、Topsil C18、Thermo Hypersil Gold C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 對(duì)相對(duì)校正因子的影響,結(jié)果見表3,可知均無(wú)明顯影響(RSD＜5%)。

2.12.2 柱溫 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,考察柱溫23、24、25、26、27 ℃對(duì)相對(duì)校正因子的影響,結(jié)果見表4,可知均無(wú)明顯影響(RSD＜5%)。

2.12.3 體積流量 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,考察體積流量0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min 對(duì)相對(duì)校正因子的影響,結(jié)果見表5,可知均無(wú)明顯影響(RSD＜5%)。

表2 各成分相對(duì)校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

表4 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.4 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.13 色譜峰定位 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,考察“2.12.1” 項(xiàng)下儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響,結(jié)果見表6,可知均無(wú)明顯影響(RSD＜5%)。

表5 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.5 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

表6 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響Tab.6 Effects of different instruments and columns on relative retention time

2.14 樣品含有量測(cè)定 取3 批顆粒,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,每批3 份,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含有量,結(jié)果見表7,可知2 種方法所得結(jié)果無(wú)明顯差異[相對(duì)平均偏差(RAD) ＜5.0%]。

表7 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg/g）Tab.7 Results of content determination of various components （mg/g）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 表虛感冒顆粒中桂枝發(fā)汗解肌,助陽(yáng)化氣[12],為君藥；白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng),斂陰止汗,為臣藥；葛根解肌退熱,炒苦杏仁降氣止咳平喘,合為佐藥；大棗益氣和中,生姜發(fā)汗解表,引藥入肺,合為使藥,諸藥合用,共奏散風(fēng)解肌、和營(yíng)退熱之功效。肉桂酸、桂皮醛等揮發(fā)油為桂枝主要藥效成分,芍藥苷、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等單萜為白芍主要活性成分,3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷等異黃酮為葛根主要特征成分。因此,本實(shí)驗(yàn)按照中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則,選取上述化合物作為指標(biāo)成分,可更全面地評(píng)價(jià)表虛感冒顆粒整體質(zhì)量。

3.2 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)首先考察了提取溶劑 (甲醇[13]、30% 乙醇[8]、50% 乙醇[6-7]、70%乙醇[9,14]),發(fā)現(xiàn)50%乙醇提取時(shí)各成分綜合提取率最佳。再考察了提取方式 (超聲[6-7,14]、加熱回流[8-9])、提取時(shí)間 (15、30、60 min),發(fā)現(xiàn)超聲提取30 min 時(shí)各成分均能提取完全,可能與表虛感冒顆粒中6 味藥材均經(jīng)水煎煮后入藥有關(guān)。

3.3 含有量分析 表7 顯示,不同批次樣品之間各成分含有量存在一定差異,以氧化芍藥苷、染料木苷、肉桂酸更明顯,可能與原藥材、產(chǎn)地、采收季節(jié)差異及生產(chǎn)過程中控制參數(shù)等有關(guān)。因此,建議藥品生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門進(jìn)一步完善表虛感冒顆粒質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),對(duì)原藥材來源和制劑生產(chǎn)過程加以控制,以確保該制劑質(zhì)量穩(wěn)定性和療效一致性。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定表虛感冒顆粒中氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷、肉桂酸和桂皮醛的含有量,該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確,可為全面評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量提供有力依據(jù)。