李焰焰，李夢(mèng)然，孟凡華，聶傳朋

武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建武夷山,354300

蕓香科是果樹大家庭中的重要一族，主要包含甜橙類、橘類、柚類、檸檬類和金柑類五大類，在人們的生活中占有重要地位，它們不僅果實(shí)可供食用，而且葉常綠、花芳香、樹形優(yōu)美，園林中可作為盆栽、綠籬、小喬木等綠化美化生活，并且多種成員的葉、果皮等可以提取精油、或作為藥材原料使用[1-3]。蕓香科果樹在我國(guó)南北方均有種植。研究表明，同一植物的光合能力在不同地域中往往表現(xiàn)出很大差異，相同環(huán)境下的同一類群植物的光合性能也存在較大差異[4]。

光合作用對(duì)植物的生長(zhǎng)有重要的影響，葉片是植物光合作用的重要器官。同一植物葉片的角質(zhì)層、上下表皮形態(tài)、柵欄組織、海綿組織、氣孔的形狀、氣孔密度等也隨環(huán)境的不同而有所變化。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)能快速靈敏地反映植物生理狀態(tài)及其與環(huán)境的關(guān)系，是一種理想的光系統(tǒng)探針，可迅速直接反映光合作用過程[5-7]。綜合分析這些參數(shù)可以全面反映出植物的光合能力變化。

本文選取武夷山當(dāng)?shù)卦耘嗟乃姆N蕓香科果樹：柑橘(CitrusreticulataBlanco)、檸檬(Citruslimon(L.)Burm.f.)、柚(Citrusmaxima(Burm.)Merr.)、金橘(Fortunellamargarita(Lour.)Swingle)，通過測(cè)定四種果樹坐果期的葉片解剖結(jié)構(gòu)、光合色素含量以及葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)，分析其在該區(qū)域的光合能力差異，為今后武夷山地區(qū)蕓香科果樹規(guī)模種植時(shí)的種類選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究材料為坐果期的檸檬、柚、金橘、柑橘四種果樹，樹齡5～7年。所選果樹均種植于武夷學(xué)院校園內(nèi)。實(shí)驗(yàn)于2019年4月中旬進(jìn)行測(cè)定，選取晴天的上午進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定，分別采集四種果樹向陽(yáng)處的葉片進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葉解剖結(jié)構(gòu)觀察

取新鮮成熟檸檬、柚、金橘、柑橘葉片進(jìn)行徒手橫切，將材料制作成臨時(shí)裝片，利用生物顯微鏡觀察角質(zhì)層、上下表皮結(jié)構(gòu)、柵欄組織、海綿組織；利用小刀、鑷子等輕輕刮下四種蕓香科果樹葉片下表皮，制成臨時(shí)裝片，每種果樹制作10片。選擇20倍鏡下拍攝的下表皮顯微圖片，選取制片中10個(gè)視野，對(duì)氣孔分別計(jì)數(shù)，求出其平均值，用氣孔平均值除以圖片面積,即可得出氣孔密度[8]。用Motic Live Imaging Module軟件拍照；用Motic Images Advanced(3.2)軟件測(cè)量數(shù)據(jù)。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

利用德國(guó)生產(chǎn)的Junior-PAM基礎(chǔ)型調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x，在天氣晴朗的上午，選擇完全處在光下的植物葉片，暗適應(yīng)15～20 min后放到磁性葉夾上進(jìn)行測(cè)定。測(cè)量時(shí)間為上午8:20～10:00，測(cè)量時(shí)間間隔為20 min。四種蕓香科果樹葉的葉綠素?zé)晒鈪?shù)包括最大光量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、實(shí)際光量子產(chǎn)量(Y(Ⅱ))、非光化學(xué)淬滅(NPQ)、光化學(xué)淬滅(qP)等。各參數(shù)直接從儀器中直接導(dǎo)出，各參數(shù)數(shù)值均由選定模式下儀器系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算生成。光合參數(shù)計(jì)算公式分別為:(Fv/Fm) = (Fm-Fo)/Fm、Y(Ⅱ)=ΔF/Fm′=(Fm-Ft)/Fm′、qP=(Fm′-Ft)/(Fm′-Fo)、NPQ=(Fm-Fm′)/Fm′、ETR=(Fm′-Ft)/Fm′×PAR×0.84×0.5，其中，PAR表示照射的光合有效輻射強(qiáng)度，0.84為吸光系數(shù)，0.5表示傳遞一個(gè)電子需要吸收兩個(gè)光子。

1.2.3 葉綠素含量測(cè)定

參考陳建勛的方法測(cè)量葉片的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b、類胡蘿卜素的含量[9]。取新鮮成熟的四種蕓香科果樹葉片，洗凈并擦干、研磨、過濾、定容，最后將濾液在紫外分光光度計(jì)下測(cè)量吸光度，最后計(jì)算光合色素含量。

計(jì)算公式:

Chla(mg/L)=12.7A663-2.69A645;

Chlb(mg/L)=22.9A645-4.68A663;

Chl(mg/L)=Chla+Chlb

=20.2A645+8.02A663;

Ck(mg/L)=4.7A440-0.27Chl。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 23.0 和Excel 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并制圖，采用單因素ANOVA進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片解剖結(jié)構(gòu)特征和氣孔特征

葉解剖結(jié)構(gòu)與光合能力之間存在聯(lián)系，尤其是柵欄組織的厚度、氣孔密度、大小等與光合能力的關(guān)系最為密切；一般來說柵欄組織較厚的植物葉片，其光合能力具有明顯的優(yōu)勢(shì)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)顯微觀測(cè)發(fā)現(xiàn)四類葉片柵欄組織分布不同：柑橘的柵欄組織分布于葉片的背面和腹面，檸檬、柚、金橘的柵欄組織主要分布于腹面。四類葉片海綿組織和柵欄組織有較大差異，柵欄組織為排列整齊的長(zhǎng)柱形，一般分2～3層，大量的葉綠體分布于柵欄組織內(nèi)，但葉綠體比較??；海綿組織細(xì)胞不規(guī)則，間隙較大，排列疏松，葉綠體在海綿組織細(xì)胞內(nèi)分布的數(shù)量較少，但葉綠體較大。

顯微觀測(cè)可見四種果樹葉片上表皮細(xì)胞均呈長(zhǎng)方形，在厚度上(表1)柚的上表皮最厚，金橘和柑橘次之，檸檬相對(duì)較薄。下表皮厚度上，柚的最厚、檸檬次之、柑橘和金橘的下表皮相對(duì)較薄。金橘和柚的角質(zhì)層最厚、柑橘次之、檸檬角質(zhì)層最薄，以上3個(gè)指標(biāo)在各等級(jí)間皆差異顯著(P<0.05)。比較四種果樹葉片上、下表皮厚度的差別，除檸檬外，其余三種均以上表皮更厚。柑橘的柵欄組織較厚，金橘次之，檸檬和柚的柵欄組織相對(duì)較?。昏值暮＞d組織相對(duì)較厚、檸檬葉海綿組織最薄，柑橘、金橘居中，四種蕓香科柵欄組織、海綿組織厚度間均差異顯著(P<0.05)。同時(shí)觀察到柚、柑橘、金橘、檸檬四種蕓香科果樹葉片氣孔主要為不規(guī)則形，且氣孔主要分布在下表皮。檸檬與金橘、柚氣孔密度有顯著差異，檸檬與柑橘氣孔密度無顯著差異，且檸檬的氣孔密度較大，柑橘次之，柚和金橘氣孔密度最小。

表1 四種蕓香科果樹葉片解剖結(jié)構(gòu)比較

2.2 光合色素含量比較

光合色素含量高低對(duì)光合能力有影響。綠色植物的光合色素中，能進(jìn)行光能轉(zhuǎn)換和光能傳遞的主要是葉綠素，葉綠素含量的高低是反映植物光合能力的重要指標(biāo)之一[11]，類胡蘿卜屬于天線色素的一種，主要作用是吸收光能并傳遞光能。由表2可以看出，四種蕓香科果樹的葉綠素素a、葉綠素總量和類胡蘿卜素含量存在顯著差異(P<0.05)，檸檬的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)含量最高，而檸檬的類胡蘿卜素含量最低；金橘的類胡蘿卜素含量最高。葉綠素b含量檸檬和柑橘處于同一水平，高于柚、金橘，三類之間差異顯著(P<0.05)。

表2 四種蕓香科葉片中光合色素含量比較 mg/L

2.3 四種蕓香科果樹葉綠素?zé)晒鈪?shù)分析

2.3.1 最大光化學(xué)量子效率和實(shí)際光化學(xué)量子效率

最大光化學(xué)量子效率Fv/Fm反映植物的最大光能轉(zhuǎn)換效率，一般情況下較穩(wěn)定，多數(shù)高等植物在正常情況下為0.83左右。由圖1可知，在測(cè)量時(shí)間8:20～10:00這段時(shí)間內(nèi)四種蕓香科果樹葉片最大光化學(xué)量子效率Fv/Fm大小幾乎沒有上下波動(dòng)，檸檬0.62、金橘0.59、柚0.52、柑橘0.46;檸檬、金橘的Fv/Fm大于柚、柑橘，柑橘的Fv/Fm最小,且檸檬、金橘、柑橘、柚這四種蕓香科果樹最大光化學(xué)量子效率都小于0.80。

實(shí)際光化學(xué)量子效率Y(Ⅱ)能反映植物對(duì)光能轉(zhuǎn)換的實(shí)際效率，Y(Ⅱ)值越大，轉(zhuǎn)換光能的能力越強(qiáng)。由圖1可知，四種蕓香科果樹上午的Y(Ⅱ)有明顯波動(dòng)：金橘和檸檬的Y(Ⅱ)曲線變化趨勢(shì)較一致，先下降后升高，最后趨于平穩(wěn)；柑橘在Y(Ⅱ)曲線變化中先上升，后趨于平穩(wěn)，再下降，最后上升；柚在Y(Ⅱ)曲線變化中先下降，后上升，再下降；金橘的實(shí)際光化學(xué)量子效率Y(Ⅱ)的曲線水平最高，其次是檸檬、柑橘、柚。

圖1 四種蕓香科果樹最大光量子效率和實(shí)際光量子效率變化

2.3.2 光化學(xué)淬滅系數(shù)qP和非光化學(xué)淬滅系數(shù)qN

由圖2可知，金橘的qP曲線變化為先上升后下降；檸檬的qP曲線為先下降后升高；柑橘qP曲線變化不明顯；三者后期皆趨于平穩(wěn)。柚qP曲線變化為先上升后下降，之后緩慢攀升至平穩(wěn)狀態(tài)。柑橘和金橘的qP水平始終高于檸檬和柚，但兩者間無顯著差異，檸檬的qP整體高于柚，且存在顯著差異。

柚、檸檬、柑橘、金橘這四種蕓香科植物非光化學(xué)淬滅系數(shù)在測(cè)量時(shí)間內(nèi)的均值具有較為顯著的差異，柚的qN值顯著大于其他三者；由圖2可知，柚和柑橘的qN變化曲線較一致，緩慢上升；金橘qN變化曲線為先升高后下降；檸檬的qN變化曲線為先降再升最后再下降；qN值整體上柚>柑橘>金橘>檸檬。

圖2 四種蕓香科果樹光化學(xué)淬滅系數(shù)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)變化

2.3.3 相對(duì)電子傳遞速率及葉綠素?zé)晒鈪?shù)綜合分析

電子傳遞速率ETR反映實(shí)際光強(qiáng)下的相對(duì)電子傳遞效率。由圖3可知，金橘的ETR高于檸檬、柑橘、柚,與Y(Ⅱ)的高低順序一致(圖1)。金橘和檸檬的ETR在8:40出現(xiàn)下降(檸檬降幅更大)，在余下的上午時(shí)間段內(nèi)一直保持平穩(wěn)；柑橘和柚的ETR波動(dòng)明顯，至10:00時(shí)柚的ETR最低，與金橘、檸檬、柑橘差異顯著。對(duì)四種果樹的葉綠素?zé)晒鈪?shù)的綜合分析可知，金橘的Y(Ⅱ)、ETR、qP最高，且與柑橘、檸檬、柚之間有顯著差異(P<0.05)，而柑橘和檸檬之間無顯著差異。

圖3 四種蕓香科果樹光合電子傳遞速率變化

3 結(jié)論與討論

3.1 葉解剖結(jié)構(gòu)和氣孔特征

光照、溫度、水分、大氣、土壤肥力等環(huán)境因素都會(huì)影響植物的生長(zhǎng)，大自然使得每種植物形態(tài)結(jié)構(gòu)具有不同的特征。而結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)，植物結(jié)構(gòu)的變化必然影響其生理生態(tài)功能。通過對(duì)比柚、金橘、柑橘、檸檬四種果樹葉解剖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)層厚度：金橘≈柚>柑橘>檸檬；上表皮厚度：柚>柑橘≈金橘>檸檬；海綿組織厚度：柚>柑橘>金橘>檸檬；下表皮厚度：柚>檸檬>柑橘≈金橘；柚葉片的角質(zhì)層、上下表皮、海綿組織相對(duì)較厚，柚的葉片的總厚度也高于檸檬、柑橘、金橘，說明柚葉片可以儲(chǔ)存較多的水分，抵抗干旱脅迫的能力較強(qiáng)。

檸檬、柚、金橘海綿組織和柵欄組織分化較為明顯，柵欄組織分布于葉片腹部，柵欄組織細(xì)胞內(nèi)的葉綠體多而小；海綿組織分布于葉片背部，其內(nèi)的葉綠體少而大；柑橘葉片的腹面和背面都有柵欄組織的存在，海綿組織散布在兩部分柵欄組織之中；前人研究表明，光合速率與柵欄組織細(xì)胞的形狀、數(shù)目及排列方式等均有關(guān)[12]，其中陳蘭華研究甜橙得到結(jié)果為葉厚度、氣孔密度與光合速率的相關(guān)性達(dá)極顯著水平,而柵欄組織厚度與光合速率的相關(guān)性不顯著[13]。本實(shí)驗(yàn)四種果樹的氣孔密度由大到小為：檸檬≈柑橘>金橘>柚；雖然四種果樹中檸檬與柑橘氣孔密度無顯著差異，且柑橘柵欄組織最厚，但是分析最大光化學(xué)量子效率和實(shí)際光化學(xué)量子效率得到金橘和檸檬Fv/Fm、Y(Ⅱ)值比較大,因此較符合陳蘭華的研究結(jié)果,可以推斷出檸檬的光合能力較強(qiáng)。而楊森關(guān)于橡膠樹解剖結(jié)構(gòu)表明柵欄組織高度發(fā)達(dá)，既可以避免植物葉肉細(xì)胞受強(qiáng)光灼傷，又可以使葉片充分利用衍射光進(jìn)行光合作用[14]；本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果中四種果樹柵欄組織厚度大小為：柑橘>金橘>檸檬>柚。

3.2 光合色素含量

葉綠素在光合作用中起著重要作用,其中葉綠素b為天線色素，可對(duì)光能進(jìn)行吸收，葉綠素a是光反應(yīng)中心復(fù)合體的主成分，對(duì)長(zhǎng)波長(zhǎng)光照有吸收作用，在光合反應(yīng)中轉(zhuǎn)化能量[15]，葉綠素的含量與光合作用密切相關(guān)，其值的大小可反應(yīng)植物的光合能力的大小。本實(shí)驗(yàn)中檸檬的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)含量皆顯著高過另外三類果樹，表明檸檬的光能捕獲、吸收性能更勝一籌。

3.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)

最大光化學(xué)量子效率Fv/Fm反映最大光能轉(zhuǎn)換效率，F(xiàn)v/Fm一般情況下較穩(wěn)定，不會(huì)因植物種類而改變，F(xiàn)v/Fm在非脅迫條件下比較恒定，一般為0.80～0.85[16]。檸檬、金橘、柑橘、柚這四種蕓香科果樹最大光化學(xué)量子效率都小于0.80，檸檬≈金橘>柚>柑橘，猜測(cè)可能是由于受到了某種脅迫，柑橘和柚受到的脅迫相對(duì)較大，檸檬和金橘受到的脅迫相對(duì)較少，具體原因還需要深入研究。四種果樹實(shí)際光化學(xué)量子效率Y(Ⅱ)：金橘>檸檬≈柑橘>柚,說明在PSⅡ中金橘的實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率最高，金橘能將吸收的光能合理的應(yīng)用到光合作用中。

光化學(xué)淬滅系數(shù)qP是光合速率增大導(dǎo)致的熒光產(chǎn)量淬滅的一種現(xiàn)象，非光化學(xué)淬滅是熱耗散而導(dǎo)致的熒光淬滅。qP值的大小反映的是PSⅡ原初電子受體QA的氧化還原狀態(tài)和PSⅡ開放中心的數(shù)目，其值越大，說明PSⅡ具有較高的電子傳遞活性[16]。四種果樹qP柑橘≈金橘>檸檬≈柚,表明柑橘、金橘以光合作用形式利用能量的能力大于檸檬和柚。

非光化學(xué)淬滅系數(shù)qN是一種自我保護(hù)機(jī)制，可以保護(hù)PSⅡ反應(yīng)中心免受因吸收過多光能而引起的光氧化傷害，當(dāng)植物處于脅迫條件時(shí)，qN值增大[17]。qN：柚>柑橘>金橘>檸檬，說明柚能將吸收過剩的能量以熱能的形式耗散，柚保護(hù)光合機(jī)構(gòu)的能力大于柑橘、金橘、檸檬，由此推想柚靠熱耗散來保護(hù)自身光合機(jī)構(gòu)免受損害的能力較強(qiáng)。這與之前根據(jù)四種果樹Fv/Fm值的推斷一致。

上述葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化反映出果樹生長(zhǎng)過程中光合生理的復(fù)雜性。綜合上述參數(shù)分析推斷得出，在該地區(qū)4月中旬時(shí)，檸檬和金橘的光合能力整體優(yōu)于柑橘和柚，這可能與四種果樹的生長(zhǎng)期差異有關(guān)，因此，對(duì)于四種蕓香科果樹各個(gè)物候期的光合能力變化還有待進(jìn)一步深入研究。