陳 軍，魯 豪

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州，234000

蘋(píng)果是人們最受歡迎的水果之一。蘋(píng)果在受到機(jī)械傷害、長(zhǎng)期保藏或深加工過(guò)程中常會(huì)發(fā)生酶促褐變，酶促褐變不但會(huì)對(duì)外觀、味道、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及加工性能造成影響，而且還顯著縮短保質(zhì)期。發(fā)生酶促褐變的原因是蘋(píng)果中的氧化酶將多酚氧化成醌，醌類物質(zhì)接著聚合成為類黑色素，使產(chǎn)品外觀顏色改變[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，水果中多酚化合物和多酚氧化酶呈現(xiàn)區(qū)域化的分布特征，正常情況下水果不易發(fā)生褐變，是因?yàn)槎喾哟嬖谟谒褪卟说囊号輧?nèi)，多酚氧化酶卻存在于質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，沒(méi)有受到機(jī)械損傷的情況下兩者不會(huì)有接觸。鮮切產(chǎn)品在生產(chǎn)和加工過(guò)程中遭到機(jī)械傷害，改變了酚類物質(zhì)和多酚氧化酶區(qū)域化的分布，導(dǎo)致酶與底物的相遇造成褐變[5-8]。本研究以鮮切蘋(píng)果為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)測(cè)定鮮切蘋(píng)果不同部位褐變度、多酚含量以及相關(guān)酶活性，探究鮮切蘋(píng)果在儲(chǔ)存期間各指標(biāo)的變化規(guī)律，為鮮切蘋(píng)果的儲(chǔ)存和保鮮以及蘋(píng)果的加工和處理奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑、儀器

1.1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)材料：紅元帥、紅富士、阿克蘇3種蘋(píng)果。

1.1.2 試 劑

乙醇； 0.2 mol/L pH 6.5磷酸緩沖液；0.5 mol/L兒茶酚溶液；0.05 mol/L pH 5.5磷酸緩沖液；0.02 mol/L H2O2；0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚；50 mmol/L pH 8.8硼酸-硼砂提取緩沖液； 0.02 mol/L L-苯丙氨酸溶液；1 mol/L Na2CO3溶液；0.25 mol/L福林酚試劑(FC試劑)；焦性沒(méi)食子酸；聚乙烯吡咯烷酮(PPVP)。

1.1.3 儀 器

HH-S恒溫水浴鍋(濟(jì)南捷島分析儀器有限公司)；R-1001LN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(廣州市星燦儀器有限公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)H1850(南京曉曉儀器設(shè)備有限公司)、UV-5100H型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(濟(jì)南捷島分析儀器有限公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將蘋(píng)果清洗干凈，削下果皮并切成1 cm2大小的片狀，將果肉切成面積為1 cm2，厚度為3 mm的塊狀，果核切成碎塊，籽去掉。將切好的果皮、果肉、果核分開(kāi)用聚乙烯保鮮膜密封包裝，置于實(shí)驗(yàn)室冰箱中貯藏備用。

1.2.2 多酚氧化酶(PPO)活性的測(cè)定

稱取5.0 g樣品放入研缽內(nèi)，加入0.1 g聚乙烯吡咯烷酮(PPVP)，然后加20 mL 0.2 mol/L pH 6.5磷酸緩沖液，充分研磨至勻漿狀態(tài)，離心30 min(4000 r/min，4 ℃)，取上清液就是粗酶液。取磷酸鹽緩沖液2.5 mL于比色皿中，加入1 mL 0.5 mol/L兒茶酚溶液，加0.5 mL酶液，于410 nm處比色，測(cè)3 min內(nèi)吸光值變化，從加入粗酶液后開(kāi)始，每經(jīng)過(guò)30 s記錄一次OD值，以每分鐘吸光度變化0.001所需要酶的量作為一個(gè)酶活力單位，測(cè)定重復(fù)三次[9]。

1.2.3 過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定

酶提取液的制備與PPO相同。取2.5 mL 0.05 mol/L pH 5.5的磷酸緩沖液、加0.5 mL 0.02 mol/L H2O2、再加0.5 mL 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚，然后加0.5 mL酶液開(kāi)始反應(yīng)，于470 nm下測(cè)3 min內(nèi)吸光度的改變。每經(jīng)過(guò)30 s記錄一次OD值，以每分鐘吸光度改變0.001所需要酶的量作為一個(gè)酶活力單位，以上測(cè)定均重復(fù)三次[9]。

1.2.4 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測(cè)定

參照曹建康等[10]的方法并對(duì)其進(jìn)行修改。稱取5g樣品放入研缽內(nèi)，加20 mL 0.05 mol/L pH 8.8硼酸-硼砂提取緩沖液，研磨至勻漿狀態(tài)，離心30 min(4 000 r/min，4 ℃)，取上清液就是粗酶液。取0.5 mL酶液，加3 mL 0.05 mol/L pH 8.8的硼酸-硼砂提取緩沖液和0.5 mL 0.02 mol/L L-苯丙氨酸溶液，將反應(yīng)液放入30 ℃恒溫水浴中，0.5 h后用紫外分光光度計(jì)測(cè)290 nm波長(zhǎng)下吸光值的改變。規(guī)定每小時(shí)290 nm下吸光值變化0.01所需酶的量為一個(gè)酶活力單位，以上測(cè)定均重復(fù)三次。

1.2.5 總酚含量的測(cè)定

參考Folin-Ciocalteu法[11]測(cè)總酚含量并加以修改。稱取10 g樣品放入研缽內(nèi)，加適量Vc和蒸餾水搗碎，再加40 mL 70%乙醇，倒入三角瓶?jī)?nèi)，然后于50 ℃水浴中攪拌提取30 min，提取液過(guò)濾3次，所得上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，回收乙醇，最終所得的就是粗提取物。稱取25 mg焦性沒(méi)食子酸于燒杯中，用蒸餾水溶解，然后轉(zhuǎn)到1000 mL容量瓶?jī)?nèi)，室溫下定容。取7支25 mL的容量瓶，依次向內(nèi)加入配制好的焦性沒(méi)食子酸溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL，然后分別加入0.25 mol/L的FC試劑1.0 mL，混勻，加入配制好的1 mol/L Na2CO35 mL定容；30 ℃避光存放，測(cè)760 nm處吸光值，一個(gè)樣品平行測(cè)三次，取三次結(jié)果的平均值。以焦性沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL)作為橫坐標(biāo)，測(cè)定的吸光度作為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

向10 mL容量瓶?jī)?nèi)先加2 mL多酚提取液，然后再依次加入1.0 mL 0.25 mol/L的FC試劑、5 mL 1 mol/L Na2CO3，最后以蒸餾水定容，然后于30 ℃水浴中放置30 min，取出進(jìn)行冷卻，測(cè)760 nm下吸光度，對(duì)照試驗(yàn)則以蒸餾水替代樣品。按照以下公式換算成總酚含量：

ω=(C×V×N)/M

ω為總酚含量(μg/mL)，C為焦性沒(méi)食子酸的質(zhì)量濃度(μg/mL)，V為提取液體積(mL)，N為稀釋倍數(shù)，M為取樣量(mL)。

1.2.6 褐變度的測(cè)定

參照Min等[12]的方法并略做修改，稱取5 g樣品放入研缽內(nèi)，加20 mL 95%乙醇進(jìn)行提取黑色素，研磨至勻漿狀態(tài)，在4 ℃，4 000 r/min離心20 min，取上清液放入冰箱中保存以備取用。測(cè)定褐變度時(shí)，加入提取液到比色皿三分之二處，以95%乙醇作為對(duì)照，在420 nm處測(cè)其OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 三種鮮切蘋(píng)果不同部位PPO活性的變化

PPO廣泛存在于各種果蔬中，它能夠催化各種酚類物質(zhì)形成醌[13]。當(dāng)蘋(píng)果組織受到機(jī)械損傷時(shí)，PPO能在短時(shí)間內(nèi)快速感應(yīng)，其活性也會(huì)增加。由圖1可知，鮮切蘋(píng)果在貯存過(guò)程中各部位的PPO酶活力在前期呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，到了后期階段則為下降趨勢(shì)。由圖1還可知，鮮切蘋(píng)果果核的PPO酶活力是各部位中最強(qiáng)的，變化幅度也最大，而果肉的PPO酶活力最弱，變化幅度最小。

圖1 三種蘋(píng)果不同部位PPO活性變化

2.2 三種鮮切蘋(píng)果不同部位POD活性的變化

POD是一種在水果與蔬菜中非常常見(jiàn)的氧化還原酶，它能夠催化過(guò)氧化氫和酚類氧化物生成醌類化合物，有利于清除多余的自由基，維持體內(nèi)正常的自由基動(dòng)態(tài)水平，它被普遍認(rèn)為是水果和蔬菜中抗氧化代謝的重要指標(biāo)。從圖2中可以得知，鮮切蘋(píng)果在貯存時(shí)期內(nèi)其各部位POD酶活力也是大致呈前期上升后期下降的變化規(guī)律，果核的酶活力最大，果肉酶活力最小。

圖2 三種蘋(píng)果不同部位POD活性變化

2.3 三種鮮切蘋(píng)果不同部位PAL活性的變化

PAL是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶，鮮切水果造成的傷害會(huì)誘導(dǎo)苯丙烷代謝的酶系統(tǒng)，從而造成酚類物質(zhì)的積累和后期組織褐變。由圖3可知，在鮮切蘋(píng)果貯藏過(guò)程中各部位的PAL活力的變化均大致呈前期上升后期下降的趨勢(shì)，且酶活性大小為果核>果皮>果肉。

圖3 三種蘋(píng)果不同部位PAL活性變化

2.4 三種鮮切蘋(píng)果不同部位總酚含量的變化

從圖4得知,蘋(píng)果果皮中總酚含量最多，果肉中則最少，貯存時(shí)期內(nèi)鮮切蘋(píng)果各部位總酚含量都是在逐漸減少，果皮中總酚含量前期減少的速度較快。

圖4 三種蘋(píng)果不同部位總酚含量變化

2.5 三種鮮切蘋(píng)果不同部位褐變度的變化

由圖5中可知，貯存期間三種蘋(píng)果的褐變度大致均為前期上升后期下降，在貯藏中期(第2～4天)褐變度可達(dá)到最大。同時(shí)從圖中可以看出三種蘋(píng)果果核的褐變度均處于較高的值，果肉則最低。由此可以得出，鮮切蘋(píng)果在貯藏期間，果核最容易發(fā)生褐變，果肉則較不易褐變。

圖5 三種蘋(píng)果不同部位褐變度的變化

2.6 鮮切蘋(píng)果不同部位PPO、POD、PAL活性與褐變度的相關(guān)性

由表1得知，鮮切蘋(píng)果不同部位PPO、POD、PAL活力都與其褐變度存在一定相關(guān)性，其中果皮和果核兩個(gè)部位PPO活力和褐變度相關(guān)系數(shù)較大，R2均達(dá)到0.8以上，而POD活性與PAL活性與鮮切蘋(píng)果各部位褐變的相關(guān)性均較小。

表1 鮮切蘋(píng)果不同部位PPO、POD、PAL活性與褐變度的相關(guān)性

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究通過(guò)對(duì)三個(gè)不同品種蘋(píng)果的果皮、果肉與果核三個(gè)部位組織PPO、POD、PAL酶活力、總酚含量以及褐變度進(jìn)行測(cè)定與相關(guān)性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鮮切蘋(píng)果貯存時(shí)期內(nèi)各部位PPO、POD、PAL酶活力以及褐變度大致均在儲(chǔ)存前期呈上升后期逐漸下降的趨勢(shì)，果皮中總酚含量最多，果肉中則最少，各部位總酚含量則一直都在減少。同時(shí)得出，鮮切蘋(píng)果各部位的褐變度大小為：果核>果皮>果肉，所以得知果核最容易褐變，果皮次之，果肉是不易褐變。另外還可以得出鮮切蘋(píng)果各部位三種酶與褐變度的相關(guān)性大小為：PPO>POD>PAL，其中PPO與鮮切蘋(píng)果果核和果皮褐變度相關(guān)性最大。本研究結(jié)果可為鮮切蘋(píng)果加工和貯存中酶促褐變機(jī)理研究提供參考。