吳敏，周洪經(jīng)，李志媛，張秀雯，孫海柏，張麗霞，陳懷永

1天津市海河醫(yī)院，天津300350；2國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥防治傳染病重點(diǎn)研究室

結(jié)核病是全球范圍內(nèi)致死的十大原因之一，每年有數(shù)百萬人患上結(jié)核病。據(jù)世界衛(wèi)生組織估算，2017年全球結(jié)核病潛伏感染人群約為17億，中國(guó)估算結(jié)核病新發(fā)患者數(shù)為88.9萬，估算結(jié)核病發(fā)病率為63/10萬，在30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中估算結(jié)核病發(fā)病率排第28位。估計(jì)2017年全球有55.8萬人為耐利福平結(jié)核?。≧R-TB），而這些人中有82%為多重耐藥結(jié)核?。∕DR-TB）［1-4］?？菇Y(jié)核一線藥物鏈霉素（SM）、異煙肼（INH）、利福平（RIF）、乙胺丁醇（EMB）有強(qiáng)殺菌作用，價(jià)格低廉，不良反應(yīng)少，可口服，是治療肺結(jié)核的基本用藥之一；相對(duì)于一線藥物來說，抗結(jié)核二線藥物卷曲霉素（CPM）、卡那霉素（KAN）、氧氟沙星（OFX）、對(duì)氨基水楊酸（PAS）臨床療效較差，毒性較大，主要用于對(duì)一線抗結(jié)核藥物不耐受者，一旦出現(xiàn)不良反應(yīng)應(yīng)立即停止服藥。因此，正確的抗結(jié)核藥物的選擇對(duì)結(jié)核病的治療起關(guān)鍵作用。目前檢測(cè)抗結(jié)核菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)為改良羅氏比例法，它可以檢測(cè)SM、INH、RIF、E 4種抗結(jié)核一線藥物和CPM、KAN、OFX、PAS 4種二線藥物，但檢測(cè)藥物種類固定，且周期長(zhǎng)。最低抑菌濃度法（MIC法）是一種比較新的藥敏檢測(cè)方法，可以檢測(cè)4種一線抗結(jié)核藥物和10種二線抗結(jié)核藥物［SM、INH、RFP、EMB、左氧氟沙星（Lfx）、阿米卡星（Am）、CPM、丙硫異煙胺（Pto）、力克肺疾（PI）、莫西沙星（Mfx）、Pas、利福布?。≧fb）、卡那霉素（KAN）、氯法齊明（Cfz）］，其操作簡(jiǎn)便，報(bào)告時(shí)間快，且準(zhǔn)確率高［5-7］。本研究采用MIC法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)129例分枝桿菌培養(yǎng)陽性菌株，并以改良羅氏比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)作對(duì)照，分析MIC法檢測(cè)抗結(jié)核藥物的準(zhǔn)確性和符合率。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑及儀器 選取天津市海河醫(yī)院2019年6—8月結(jié)核科住院患者和門診患者培養(yǎng)分枝桿菌陽性菌株129份（參照結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)方法，即取1 mg/mL菌液100μL滴到檢測(cè)的樣本滴下部，15 min后觀察檢測(cè)板的判定部；檢測(cè)線及質(zhì)控線雙方都確認(rèn)出現(xiàn)紫紅色條帶判定為陽性，提示樣本中有結(jié)核菌的存在；檢測(cè)線處沒有出現(xiàn)紫紅色條帶，只在質(zhì)控線出現(xiàn)紫紅色條帶判定為陰性）。MIC分枝桿菌藥敏檢測(cè)試劑盒（培養(yǎng)法）購(gòu)自珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司，羅氏培養(yǎng)基和含藥羅氏培養(yǎng)基均購(gòu)自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）購(gòu)自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司，標(biāo)本前處理液2%N-乙酰-L半胱氨酸-NaoH消化液（2%NaoH-NALC）購(gòu)自珠海貝索生物科技股份有限公司。電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，超聲比濁儀購(gòu)自廣東體必康生物科技有限公司。

1.2 結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng) 患者標(biāo)本采用NALC法消化液前處理，取1～3 mL標(biāo)本于50 mL離心管中，加入2倍體積的前處理液消化震蕩15 s液化，靜置15 min，加入無菌生理鹽水至45 mL，然后以4 000 r/min速度離心20 min，棄去上清，在沉淀中加入1 mL的無菌生理鹽水，震蕩重懸，取100μL接種改良羅氏培養(yǎng)基2支，放置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3 d觀察有無污染，以后每周觀察1次，2～3周后出現(xiàn)可見菌落可用于藥敏檢測(cè)［8］。

1.3 結(jié)核分枝桿菌的改良羅氏比例法藥敏試驗(yàn) 取分枝桿菌陽性菌株，用一次性接種環(huán)取部分菌落至含2 mL生理鹽水的超聲比濁管中，調(diào)菌液濃度為1 mg/mL，分別取高稀釋度（10-4）菌液一環(huán)，劃線接種空白對(duì)照培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基（SM 4μg/mL、INH 0.2μg/mL、RFP 40μg/mL、EMB 2μg/mL、CPM 40μg/mL、PAS 1μg/mL、OFX 2μg/mL、KAN 30μg/mL）；然后分別取低稀釋度（10-2）菌液一環(huán)，劃線接種空白對(duì)照培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4周后觀察結(jié)果。質(zhì)控菌株H37RV作為全敏感標(biāo)準(zhǔn)菌株，由天津市疾病控制中心提供。計(jì)算耐藥百分比，耐藥百分比=含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌落數(shù)×100%，若耐藥百分比≥1%，則判斷為耐藥［8］。

1.4 結(jié)核分枝桿菌的MIC法藥敏試驗(yàn) 分離獲得處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)核分枝桿菌，磨菌比濁至1 mg/mL。取出凍干雜菌抑制劑，將無菌稀釋液全部加入后充分搖勻。取出藥敏培養(yǎng)基及藥敏測(cè)試板，吸取100μL混合均勻的雜菌抑制劑加入藥敏培養(yǎng)基，充分混勻。用無菌吸嘴先分別吸取180μL藥敏培養(yǎng)基加入到A1或E1、B1或F1，分別作為1/10、1/100參照孔。用無菌吸嘴吸取200μL藥敏培養(yǎng)基加 入 到C1、D1或G1、H1作 為 陰 性 參 照 孔。取100μL菌液（1 mg/mL）加入到整支藥敏培養(yǎng)基中混勻。每孔加200μL含有菌液的藥敏培養(yǎng)基（除上述4孔），再吸20μL至A1或E1孔作為1/10參照孔，從A1或E1孔吸20μL至B1或F1作為1/100參照孔，蓋上盒蓋，用透明膠帶沿周邊封一圈后，置37℃培養(yǎng)，7～10 d后觀察結(jié)果?？椎壮霈F(xiàn)白色菌體沉淀為陽性［9］，利用微生物常規(guī)藥敏試驗(yàn)掃描系統(tǒng)可直接得到藥敏結(jié)果。耐藥判斷標(biāo)準(zhǔn)（最佳臨界值）：SM 4μg/mL，INH 0.2μg/mL，RFP 4μg/mL，EMB 2.5μg/mL，Lfx 2μg/mL，Am 1μg/mL，CPM 2.5μg/mL，Pto 10μg/mL，PI 0.5μg/mL，Mfx 0.5μg/mL，Pas 2μg/mL，Rfb 0.75μg/mL，KAN 2.5μg/mL，Cfz 2μg/mL。

1.5 微量MIC法在結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測(cè)中準(zhǔn)確性評(píng)估 以改良羅氏比例法藥敏實(shí)驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，通過計(jì)算敏感度、特異度、陰性預(yù)測(cè)值、陽性預(yù)測(cè)值及其診斷符合率，以評(píng)價(jià)微量MIC法再分枝桿菌藥敏檢測(cè)中的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

改良羅氏比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果：對(duì)于SM敏感菌有100株，耐藥菌有29株；對(duì)于INH敏感菌有101株，耐藥菌有28株；對(duì)于RFP敏感菌有109株，耐藥菌有20株；對(duì)于EMB敏感菌有118株，耐藥菌有11株；對(duì)于KAN敏感菌有124株，耐藥菌有5株；對(duì)于氨基水楊酸敏感菌有125株，耐藥菌有4株；對(duì)于OFX敏感菌有108株，耐藥菌有21株；對(duì)于CPM敏感菌有125株，耐藥菌有4株。

MIC法藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)于SM敏感菌有103株，中敏菌有4株，耐藥菌有22株；對(duì)于INH敏感菌有102株，中敏菌有0株，耐藥菌有27株；對(duì)于RFP敏感菌有109株，中敏菌有1株，耐藥菌有19株；對(duì)于EMB敏感菌有117株，中敏菌有9株，耐藥菌有3株；對(duì)于左氧氟沙星敏感菌有112株，中敏菌有15株，耐藥菌有2株；對(duì)于阿米卡星敏感菌有124株，中敏菌有0株，耐藥菌有5株；對(duì)于CPM敏感菌有123株，中敏菌有6株，耐藥菌有0株；對(duì)于Pto敏感菌有127株，中敏菌有2株，耐藥菌有0株；對(duì)于PI敏感菌有116株，中敏菌有8株，耐藥菌有5株；對(duì)于莫西沙星敏感菌有111株，中敏菌有11株，耐藥菌有7株；對(duì)于對(duì)氨基水楊酸敏感菌有121株，中敏菌有4株，耐藥菌有4株；對(duì)于Rfb敏感菌有114株，中敏菌有14株，耐藥菌有1株；對(duì)于KAN敏感菌有116株，中敏菌有8株，耐藥菌有5株；對(duì)于氯法齊明敏感菌有128株，中敏菌有0株，耐藥菌有1株。

兩種檢測(cè)方法中，有7種藥物為其共有，以改良羅氏比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為金標(biāo)準(zhǔn)，MIC法中敏菌和耐藥菌合并為一組數(shù)據(jù)，通過計(jì)算靈敏度、特異度、陰性預(yù)測(cè)值、陽性預(yù)測(cè)值及其診斷符合率結(jié)果表明；對(duì)于SM藥敏檢測(cè)的靈敏度為100.0%，特異度為97.1%，陽性預(yù)測(cè)值為89.6%，陰性預(yù)測(cè)值為100.0%，診斷符合率為97.7%；對(duì)于INH藥敏檢測(cè)的靈敏度為96.3%，特異度為98.0%，陽性預(yù)測(cè)值為92.8%，陰性預(yù)測(cè)值為99.0%，診斷符合率為97.7%；對(duì)于RFP藥敏檢測(cè)的靈敏度為95.0%，特異度為99.1%，陽性預(yù)測(cè)值為95.0%，陰性預(yù)測(cè)值為99.1%，診斷符合率為98.4%；對(duì)于EMB藥敏檢測(cè)的靈敏度為83.3%，特異度為99.1%，陽性預(yù)測(cè)值為90.9%，陰性預(yù)測(cè)值為98.3%，診斷符合率為97.7%；對(duì)于KAN藥敏檢測(cè)的靈敏度為38.5%，特異度為100.0%，陽性預(yù)測(cè)值為100.0%，陰性預(yù)測(cè)值為93.5%，診斷符合率為93.8%；對(duì)于氨基水楊酸藥敏檢測(cè)的靈敏度為50.0%，特異度為100.0%，陽性預(yù)測(cè)值為100.0%，陰性預(yù)測(cè)值為96.8%，診斷符合率為96.9%；對(duì)于CPM藥敏檢測(cè)的靈敏度為66.6%，特異度為100.0%，陽性預(yù)測(cè)值為100.0%，陰性預(yù)測(cè)值為98.4%，診斷符合率為98.4%。

3 討論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌侵襲數(shù)量達(dá)到一定程度，大于機(jī)體免疫力抵抗時(shí)容易引起疾?。?0］，結(jié)核菌可能侵犯人體各種器官，但主要侵犯肺臟，引起肺結(jié)核病，呼吸道是其傳播主要途徑。傳染源是接觸排菌的肺結(jié)核患者，臨床上多呈慢性過程，常伴有低熱、乏力等全身中毒癥狀和咳嗽、咯血等呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)，常用結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（TST）進(jìn)行篩查［11］。免疫力低下人群例如艾滋病、糖尿病患者更容易罹患該病［12-13］，其他部位（頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼）也可繼發(fā)感染引起肺外結(jié)核［14］。2021年是開啟“十四五”規(guī)劃的第一年，距離實(shí)現(xiàn)聯(lián)合國(guó)“2030年可持續(xù)發(fā)展議程”結(jié)核病控制目標(biāo)和“2035年終止結(jié)核病流行”目標(biāo)，只剩下10年和15年的時(shí)間，也將是結(jié)核病防治邁上新臺(tái)階的一年［15］。結(jié)核分枝桿菌是引起人類結(jié)核病的主要病原菌，是專性需氧的一類細(xì)菌，抗酸染色陽性，無鞭毛，有菌毛，有微莢膜但不形成芽孢，其細(xì)菌壁既沒有革蘭陽性菌的磷壁酸，也沒有革蘭陰性菌的脂多糖，細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲的桿菌，大小1～4×0.4μm。初次分離需要營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。常用的有羅氏固體培養(yǎng)基，內(nèi)含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無機(jī)鹽和孔雀綠等?？兹妇G可抑制雜菌生長(zhǎng)，便于分離和長(zhǎng)期培養(yǎng)。蛋黃含脂質(zhì)生長(zhǎng)因子，能刺激生長(zhǎng)。根據(jù)接種菌多少，一般2～4周可見菌落生長(zhǎng)。菌落呈顆粒、結(jié)節(jié)或花菜狀，乳白色或米黃色，不透明。作為胞內(nèi)致病菌，結(jié)核分枝桿菌在宿主細(xì)胞內(nèi)潛伏或增殖，其不僅能被宿主吞噬細(xì)胞所吞入，還可入侵以造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞為代表的干細(xì)胞［16］。

在我國(guó)結(jié)核菌藥敏檢測(cè)曾用絕對(duì)濃度法，但該方法對(duì)混懸液制備、接種量的要求非常嚴(yán)格，對(duì)操作者的技術(shù)要求較高，且此法未對(duì)“耐藥”“敏感”進(jìn)行明確定義。因此，改進(jìn)后羅氏比例法藥敏檢測(cè)被WHO推薦為金標(biāo)準(zhǔn)，可對(duì)藥物靈敏度試驗(yàn)中的接種量進(jìn)行校正，通過配置1麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)濃度菌液，進(jìn)行百倍稀釋和萬倍稀釋后接種含藥培養(yǎng)基，通過計(jì)數(shù)生長(zhǎng)菌落數(shù)直觀的判定敏感、耐藥。同時(shí)檢測(cè)四種抗結(jié)核一線藥物SM、INH、RFP和EMB和四種二線藥物CPM、KAN、OFX和PAS，4周后觀察結(jié)果［17］。依據(jù)所得藥敏結(jié)果，將結(jié)核病患者耐藥分為以下四種。單耐藥：結(jié)核病患者感染的結(jié)核桿菌體外被證實(shí)對(duì)一種一線藥物抗結(jié)核藥物耐藥。多耐藥：結(jié)核病患者感染的結(jié)核桿菌體外被證實(shí)對(duì)不同時(shí)包括INH、RFP在內(nèi)的一種以上的一線抗結(jié)核藥物耐藥。耐多藥（MDR-TB）：結(jié)核病患者感染的結(jié)核桿菌體外被證實(shí)至少對(duì)INH、RFP耐藥。嚴(yán)重耐多藥（XDR-TB）：結(jié)核病患者感染的結(jié)核桿菌體外被證實(shí)除了至少對(duì)兩種主要一線抗結(jié)核藥物INH、RFP耐藥外，還對(duì)任何氟喹諾酮類抗生素（如氧氟沙星）產(chǎn)生耐藥，以及三種二線抗結(jié)核注射藥物（如CPM、KAN、丁胺卡那霉素等）中的至少一種耐藥。耐多藥結(jié)核病患者一般至少需要24個(gè)月的治療，重癥患者可能需要36個(gè)月的治療，但治愈率僅為50%～60%。這使得耐多藥結(jié)核病的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)比非耐多藥結(jié)核病病例高出10～100倍。而使用二線藥物治療耐多藥結(jié)核病需要更長(zhǎng)的時(shí)間，因?yàn)槎€藥物更昂貴，副作用更多。因此，控制結(jié)核病多藥耐藥病例的比例，是我國(guó)公共衛(wèi)生工作的重中之重［18-19］。

表型檢測(cè)方法為金標(biāo)準(zhǔn)，但檢測(cè)周期較長(zhǎng)且藥物種類受限，目前只包括8種抗結(jié)核藥物。我們選擇MIC法的優(yōu)點(diǎn)為檢測(cè)所需時(shí)間較短，操作簡(jiǎn)便，所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，可同時(shí)檢測(cè)多種抗結(jié)核藥物，滿足臨床需求，同時(shí)還可以得到菌株的MIC值，更有利于指導(dǎo)臨床用藥［5］。SCH?N等［20］研究表明，適用于大多數(shù)細(xì)菌病原體的MIC檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)也應(yīng)適用于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體。MIC試驗(yàn)不同于常規(guī)藥敏試驗(yàn)在單一臨界濃度下的藥敏試驗(yàn)，它能定量地反映耐藥情況。研究［21］發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮類藥物的MIC值增加與糖尿病、年齡＞40歲與治療失敗顯著相關(guān)，與耐多藥肺結(jié)核患者治療失敗相關(guān)。劉金娜［22］研究表明，微量液體培養(yǎng)基MIC法應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)中與羅氏比例法有著良好的一致性，且檢測(cè)速度快，經(jīng)濟(jì)適用性好。馬小華等［23］發(fā)現(xiàn)，采用基因芯片法進(jìn)行NTM菌種鑒定，對(duì)不同類型菌種進(jìn)行歸類，并采用微量稀釋法進(jìn)行NTM藥物敏感試驗(yàn)，依據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)菌的MIC50和MIC90值，分析藥敏結(jié)果可以為臨床治療提供理論依據(jù)。本研究利用結(jié)核分枝桿菌MIC法和羅氏比例法藥敏檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗結(jié)核藥物靈敏度，比例法結(jié)果表明各種藥物耐藥率分別為SM 22.5%、INH 21.7%、RFP 15.5%、EMB 8.5%、KAN 3.9%、PAS3.1%、OFX 16.3%、CPM3.1%；MIC法 檢 測(cè) 結(jié) 果 為SM 20.2%、INH 20.9%、RFP 15.5%、EMB 9.3%、KAN 10.1%、PAS 6.2%、LFX 13.2%、MFX 14.0%、CPM 4.7%；兩種方法檢測(cè)結(jié)果較一致。其他抗結(jié)核藥耐藥率檢測(cè)結(jié)果為Cfz 0.8%、Pto 1.6%、PI 10.1%、Rfb 11.6%、AM 3.9%。與比例法藥敏結(jié)果相比，MIC檢測(cè)SM、INH、RFP、EMB、KAN、PAS、CPM藥物的符合率較高，分別為97.7%、97.7%、98.4%、97.7%、93.8%、96.9%、98.4%。在耐藥性檢測(cè)方面，以傳統(tǒng)比例法為金標(biāo)準(zhǔn)，MIC法對(duì)于一線藥物耐藥檢測(cè)的靈敏度和特異度都較高，對(duì)于二線藥物檢測(cè)靈敏度較低，這可能與藥物作用機(jī)制不同有關(guān)，可以進(jìn)一步做藥物機(jī)制研究的臨床驗(yàn)證。