袁漫秋，裴建贏，何鑫，田麗榮，胥敏敏，李燕平

1 蘭州大學(xué)，蘭州 730000；2 甘肅省婦幼保健院科研中心；3 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科

胃癌的發(fā)病率（5.7%）和病死率（8.2%）在消化道腫瘤中僅次于結(jié)直腸癌［1］。因此，尋找與胃癌預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物、評(píng)估胃癌患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)對(duì)指導(dǎo)臨床決策、提高患者生存率具有重要意義。鐵死亡是一種新型的細(xì)胞程序性死亡方式，在形態(tài)、生化和遺傳學(xué)上都區(qū)別于細(xì)胞凋亡、壞死和自噬等細(xì)胞死亡。鐵死亡的發(fā)生與鐵依賴(lài)過(guò)氧化脂質(zhì)的積聚并導(dǎo)致細(xì)胞的致命性損傷有關(guān)［2］。研究［3］發(fā)現(xiàn)，鐵死亡參與調(diào)節(jié)肝癌、乳腺癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展。鐵死亡在胃癌細(xì)胞中能被顯著抑制，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低癌細(xì)胞對(duì)順鉑和紫杉醇等藥物的敏感性。阿帕替尼能通過(guò)降低癌細(xì)胞谷胱甘肽水平、增加脂質(zhì)過(guò)氧化水平誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的鐵死亡，發(fā)揮抗腫瘤作用［4］。目前與鐵死亡相關(guān)的基因研究已有較多，但鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因與胃癌預(yù)后的關(guān)系目前并不十分清楚［5］。我們采取生物信息學(xué)方法篩選與胃癌預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因并分析其生物學(xué)功能，進(jìn)一步構(gòu)建胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型，對(duì)胃癌患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 在可公開(kāi)獲得的癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中檢索并下載胃癌基因微陣列圖譜及相關(guān)患者的臨床資料，將患者臨床資料和基因表達(dá)信息合并后刪除缺失值。胃癌基因微陣列圖譜包含胃癌基因的名稱(chēng)、樣本編號(hào)以及基因在不同樣本中的表達(dá)量?；颊叩呐R床信息主要包括年齡、性別、TNM 分級(jí)、腫瘤分期、生存時(shí)間、生存狀態(tài)。共計(jì)獲得407 例標(biāo)本，其中胃癌組織375例份、癌旁組織32例份。刪除缺乏隨訪信息的標(biāo)本，最終獲得胃癌組織311例份、癌旁組織32例份，共包含60個(gè)鐵死亡基因的相關(guān)信息。

1.2 與胃癌預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因篩選

1.2.1 胃癌、癌旁組織鐵死亡基因篩選 通過(guò)R軟件中的“l(fā)imma”軟件包在納入胃癌基因微陣列圖譜信息中篩選鐵死亡基因。以對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的差異表達(dá)倍數(shù)（FC，F(xiàn)old Change，差異倍數(shù)）log2FC 的絕對(duì)值|log2FC|＞1和FDR＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選為胃癌、癌旁組織鐵死亡差異表達(dá)基因。

1.2.2 與胃癌患者預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因篩選采用單因素Cox 回歸分析法分析胃癌患者的總體生存率，篩選與胃癌患者預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因（P＜0.05）。運(yùn)用R 軟件中的“Venn”軟件包對(duì)鐵死亡差異基因和胃癌患者的預(yù)后基因進(jìn)行交集。最后篩選得到胃癌預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因。

1.2.3 胃癌預(yù)后相關(guān)鐵死亡基因的生物學(xué)功能分析 采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）軟 件（https//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）探索胃癌預(yù)后相關(guān)鐵死亡基因高表達(dá)時(shí)的富集通路（NOMP＜0.05、FDR＜0.05），分析胃癌預(yù)后相關(guān)鐵死亡基因的生物學(xué)功能。

1.3 胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型構(gòu)建與驗(yàn)證

1.3.1 胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型構(gòu)建 納入“1.2”得到的胃癌預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因，運(yùn)用Lasso Cox 回歸分析法，使用“glmnet”軟件包構(gòu)建胃癌預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因的預(yù)測(cè)模型，即：胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型=eK1X1+K2X2+……KnXn。其中X 代表預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因的表達(dá)量，K 代表系數(shù)。Kn是以預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因Xn的表達(dá)量為自變量，以胃癌患者的總體生存率和生存狀態(tài)為因變量計(jì)算得到的系數(shù)。

1.3.2 胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型準(zhǔn)確性驗(yàn)證 根據(jù)預(yù)后預(yù)測(cè)模型計(jì)算數(shù)據(jù)集中隨訪信息完整的胃癌組織311 例份，并根據(jù)評(píng)分中位數(shù)將納入的胃癌患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組。下一步采用“survival”、“survminer”軟件包對(duì)高、低風(fēng)險(xiǎn)組胃癌患者的生存情況進(jìn)行分析，繪制生存曲線(xiàn)。通過(guò)“timeROC”軟件包繪制受試者工作特征曲線(xiàn)（ROC），并評(píng)估預(yù)后預(yù)測(cè)模型準(zhǔn)確性。采用“Rtsne”、“ggplot2”軟件包對(duì)模型基因中納入的鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行主成分（Principal Component Analysis，PCA）、t分布隨機(jī)鄰居嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）分析，通過(guò)變量降維驗(yàn)證預(yù)后預(yù)測(cè)模型預(yù)后評(píng)分對(duì)高、低風(fēng)險(xiǎn)的患者預(yù)后的區(qū)分程度。采用單因素Cox 回歸分析、多因素Cox 回歸分析法在“survival”軟件包中評(píng)估鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因的胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型測(cè)算的評(píng)分是否是獨(dú)立于其它臨床因素的預(yù)后因素。采用單樣本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）及“GSVA”軟件包，對(duì)不同預(yù)后胃癌患者的免疫細(xì)胞、免疫通路進(jìn)行評(píng)分，比較不同預(yù)后的胃癌患者免疫細(xì)胞、免疫通路差異。

2 結(jié)果

2.1 與胃癌患者預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因及其生物學(xué)功能 胃癌組織、癌旁組織中有41 個(gè)（68.33%，41/60）鐵死亡基因存在差異表達(dá)。其中，與癌旁組織比較，胃癌組織中ACSL3、CS、GCLC、HSBP1、

RPL8、GCLM、CARS1、SAT1、EMC2、G6PD、ABCC1、GSS、AIFM2、PHKG2、ALOX5、NFS1、ACACA、IREB2、ACSL4、CD44、GLS2、TP53、SQLE、FADS2、SLC7A11、TFRC、SLC1A5、FANCD2、NOX1 等29 個(gè)基因表達(dá)升高，CRYAB、AKR1C1、AKR1C2、MT1G、AKR1C3、HSPB1、ACSF2、NFE2L2、PEBP1、FTH1、NCOA4、ACO1等12個(gè)基因表達(dá)降低。

采用單因素Cox 回歸分析法初步篩選得到胃癌患者預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因有CHAC1、ZEB1、NFE2L2、KEAP1 及SLC1A5（HR分別為0.819，1.206，0.674，0.625，0.829；95%CI分別為0.676～0.991，1.022～1.424，0.456～0.997，0.432～0.904，0.703～0.997；P均＜0.05）。

通過(guò)Venn 圖交集后得到胃癌患者預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因?yàn)镹FE2L2、SLC1A5。其中，NFE2L2 主要參與化學(xué)刺激檢測(cè)、膜電位調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能，SLC1A5主要參與金屬離子傳輸、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶活性調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能。

2.2 鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因的胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型及其準(zhǔn)確性 胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型=e（-0.315×NFE2L2）＋（-0.161×SLC1A5）。其中，NFE2L2、SLC1A5 為胃癌組織中基因的相對(duì)表達(dá)量，-0.315、-0.161 分別為NFE2L2、SLC1A5的系數(shù)。

胃癌患者的預(yù)后評(píng)分模型測(cè)算出的患者預(yù)后評(píng)分對(duì)稱(chēng)分布、無(wú)離群值，提示該模型穩(wěn)健。與預(yù)后低風(fēng)險(xiǎn)者（157 例）比較，預(yù)后高風(fēng)險(xiǎn)者（154 例）的生存率低（P均＜0.05）。第1、2、3 年鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因的胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)患者預(yù)后的ROC曲線(xiàn)下面積分別為0.561、0.587、0.615。在患者生存狀態(tài)和預(yù)后評(píng)分分布的散點(diǎn)圖中可見(jiàn)，與預(yù)后低風(fēng)險(xiǎn)的胃癌患者比較，預(yù)后高風(fēng)險(xiǎn)的胃癌患者生存期短。PCA 分析、t-SNE 分析結(jié)果顯示，變量降維后預(yù)后評(píng)分能有效區(qū)分胃癌患者預(yù)后的高、低風(fēng)險(xiǎn)。

單因素Cox 回歸分析顯示胃癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素為年齡、性別、TNM 分級(jí)、TNM 分期、預(yù)后評(píng)分（HR分別為1.802，1.329，1.229，1.828；95%CI分別為1.237～2.624，0.907～1.984，0.845～1.786，1.253～2.667；P均＜0.05）。多因素Cox 回歸分析顯示，胃癌患者預(yù)后的影響因素有年齡、TNM 分期、預(yù)后評(píng)分（HR分別為1.974，1.862，4.151；95%CI分別為1.350～2.885，1.277～2.717，1.822～9.459；P均＜0.05）。

與低風(fēng)險(xiǎn)胃癌患者比較，高風(fēng)險(xiǎn)胃癌患者肥大細(xì)胞、輔助T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、TIL、樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）、中性粒細(xì)胞、Tfh 細(xì)胞等免疫細(xì)胞的評(píng)分高（P均＜0.05）。Ⅱ型干擾素反應(yīng)、T 細(xì)胞共刺激等免疫通路的評(píng)分高，MHC_class_Ⅰ免疫通路的評(píng)分低（P均＜0.05）。

3 討論

目前通過(guò)內(nèi)鏡下切除等治療后早期胃癌的治愈率較高，但中、晚期患者經(jīng)綜合治療后5年生存率仍較低［6］。胃癌的預(yù)后與腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及治療手段等密切相關(guān)。

鐵死亡是由氧化劑和抗氧化劑之間產(chǎn)生的氧化還原失衡引起的一種新型細(xì)胞程序性死亡方式，其通過(guò)復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控參與了包括胃癌等多種癌癥的進(jìn)程，在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖中發(fā)揮了重要作用［7］。本研究利用生物信息學(xué)方法，最終得到與胃癌預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因?yàn)镹FE2L2、SLC1A5。NFE2L2，也被稱(chēng)為NRF2，是鐵死亡過(guò)程中一個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄因子，它可以協(xié)調(diào)鐵死亡過(guò)程中大量參與鐵代謝、氧化防御和氧化還原信號(hào)的細(xì)胞保護(hù)基因的活化。在同為消化道腫瘤的肝癌中，NEF2L2 參與鐵死亡抵抗進(jìn)而對(duì)肝癌細(xì)胞起到保護(hù)作用［4］。然而，也有實(shí)驗(yàn)表明，NFE2L2 激活的血紅素氧化酶-1在鐵死亡介導(dǎo)的過(guò)程中既可表顯出保護(hù)作用，也可表現(xiàn)出細(xì)胞毒作用，因此NEF2L2 對(duì)腫瘤的具體行為并未完全確定［8］。本研究發(fā)現(xiàn)NFE2L2 表達(dá)量與預(yù)后情況正相關(guān)，可能提示保護(hù)作用，基因集富集分析提示NFE2L2 可能與化學(xué)刺激檢測(cè)、膜電位調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能有關(guān)?；蚣患治鎏崾維LC1A5與金屬離子傳輸、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶活性調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能有關(guān)。SLC1A5編碼的丙氨酸—絲氨酸—半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-2（ASCT2）所介導(dǎo)的L-谷氨酰胺攝取是鐵死亡的氨基酸代謝的重要組成部分，同時(shí)也參與多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［9］。

本研究利用模型對(duì)數(shù)據(jù)集中所有胃癌患者的預(yù)后進(jìn)行評(píng)分，并將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)者。繪制的生存曲線(xiàn)顯示高風(fēng)險(xiǎn)組相較于低風(fēng)險(xiǎn)的生存率顯著降低，表明該模型是對(duì)胃癌患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估具有實(shí)用價(jià)值。該預(yù)后預(yù)測(cè)模型所得預(yù)后評(píng)分預(yù)測(cè)患者預(yù)后的敏感度、特異度均較高，且隨時(shí)間推移，其預(yù)測(cè)患者預(yù)后的準(zhǔn)確性有逐漸增加趨勢(shì)。此外，根據(jù)預(yù)后評(píng)分散點(diǎn)圖同樣證實(shí)高、低風(fēng)險(xiǎn)組的生存率有顯著差異；在PCA 分析、t-SNE 分析中，高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者具有良好的區(qū)分，再次證實(shí)該預(yù)后評(píng)分模型的穩(wěn)定性。最后，在獨(dú)立預(yù)后分析中，該模型的預(yù)后評(píng)分成為繼年齡、分期之后胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素。綜上，本研究采用多種方法驗(yàn)證了該模型的有效性。

最后，本研究探尋了高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組在免疫學(xué)功能上的差異。結(jié)果顯示肥大細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（pDCs）和B 細(xì)胞在高風(fēng)險(xiǎn)組中評(píng)分更高。高風(fēng)險(xiǎn)組中肥大細(xì)胞評(píng)分顯著增高可能與肥大細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中分泌血管生成因子及淋巴管生成因子從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)［14］；pDCs 既能通過(guò)產(chǎn)生干擾素和白介素等細(xì)胞因子間接協(xié)調(diào)抗腫瘤免疫，又能作為抗原呈遞細(xì)胞（APC）直接參與免疫過(guò)程［11］，B 細(xì)胞可以通過(guò)產(chǎn)生抗腫瘤抗體來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)［12］。高風(fēng)險(xiǎn)組中pDCs、B 細(xì)胞的評(píng)分增高可能與高風(fēng)險(xiǎn)組的抗腫瘤反應(yīng)更為強(qiáng)烈有關(guān)。然而B(niǎo) 細(xì)胞中的一些調(diào)節(jié)B 細(xì)胞具有抑制表型，可以抑制抗腫瘤反應(yīng)，并通過(guò)產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子和抑制分子的表達(dá)來(lái)支持腫瘤的生長(zhǎng)［13］，高風(fēng)險(xiǎn)組中B細(xì)胞的增高也可能與此有關(guān)。免疫通路中高風(fēng)險(xiǎn)組的評(píng)分在Ⅱ型干擾素反應(yīng)通路、T 細(xì)胞共刺激通路上明顯高于低風(fēng)險(xiǎn)組。其中，Ⅱ型干擾素能促進(jìn)免疫抑制、逃避Ⅱ型干擾素依賴(lài)的腫瘤免疫監(jiān)視、介導(dǎo)腫瘤的生長(zhǎng)與進(jìn)展［13］。T 細(xì)胞共刺激是由抗原呈遞細(xì)胞上的共刺激配體與T細(xì)胞上的TCR 受體結(jié)合而產(chǎn)生，是激活T 細(xì)胞的非特異信號(hào)［14］。高風(fēng)險(xiǎn)組中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移可能引起更強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫，而抗腫瘤免疫所產(chǎn)生的肥大細(xì)胞、pDCs、B細(xì)胞、T細(xì)胞可能與胃癌的預(yù)后不良有關(guān)。

同時(shí)，本文還存在一定的局限性。首先，本研究是基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建并驗(yàn)證，受到了地域、人種、樣本數(shù)等方面的限制。其次，預(yù)后預(yù)測(cè)模型缺乏前瞻性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，與胃癌預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因?yàn)镕E2L2、SLC1A5，據(jù)此建立胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型為=e（-0.315×NFE2L2）＋（-0.161×SLC1A5）。該模型對(duì)胃癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值較高。與胃癌預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因NFE2L2 可能與化學(xué)刺激檢測(cè)、膜電位調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能有關(guān)，SLC1A5 可能與金屬離子傳輸、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶活性調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能有關(guān)。肥大細(xì)胞、輔助T 細(xì)胞及pDCs 等淋巴細(xì)胞，Ⅱ型干擾素反應(yīng)、T 細(xì)胞共刺激免疫通路可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。