李香凝，王金堂

湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院，湖北十堰442000

肺炎是我國5歲以下兒童死亡的主要原因之一，發(fā)病急，進展快，病程長，以發(fā)熱、咳嗽、咳痰等為主要臨床癥狀，其病原菌包括細菌、病毒、非典型病原菌（如支原體、衣原體等）和真菌，感染方式包括單一病原菌感染和混合感染，混合感染在肺炎病原菌感染中占重要比例［1］，常引起臨床癥狀嚴重的肺炎［2］，對患兒的健康生命和家庭負擔造成極大威脅。臨床早期治療肺炎多采用經(jīng)驗性用藥，但因為近年抗生素的廣泛使用，小兒肺炎致病菌對抗生素的耐藥性越發(fā)嚴重［3］，多重耐藥菌株感染率也逐年升高［4］，對于病程較長和免疫低下的肺炎患兒還需警惕真菌感染，這均可導致早期經(jīng)驗性用藥無效，加快病情進展，預后不良。早期快速診斷病原菌，針對性合理用藥，可有效提高肺炎患兒尤其是重癥、難治性肺炎及經(jīng)驗性用藥無效的肺炎患兒的治療療效，從而達到緩解病情，改善預后，降低住院率及30天內(nèi)病死率的目的［5］。已研究顯示［6］支氣管肺泡灌洗液（BALF）為標本檢測病原菌的特異度、靈敏度、檢出率及標本合格率均高于痰液。運用纖維支氣管鏡管道的柔軟性到達肺部病灶處收集灌洗液作為標本，在一定程度上避免了口腔定植菌的干擾，增加了標本的可靠性和合格率，從而增加了病原菌的檢出率［7］。兒童肺炎支氣管肺泡灌洗液病原菌檢測方法主要有4種：使用培養(yǎng)基進行病原分離培養(yǎng)的病原菌培養(yǎng)法、對特定病原菌DNA進行擴增的聚合酶鏈式反應法（PCR法）、新型恒溫病原菌核酸擴增的環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）和基于高通量直接檢測病原菌核酸的宏基因二代測序（mNGS），這4種檢測方法對小兒肺炎的病原菌診斷、指導用藥和評估治療療效均具有重要意義，但各自有不同的優(yōu)勢和局限性?，F(xiàn)對支氣管肺泡灌洗液病原菌檢測方法及其在兒童肺炎診治中的應用進展進行綜述。

1 病原菌培養(yǎng)法在兒童肺炎診治中的應用

傳統(tǒng)病原菌培養(yǎng)法是將灌洗液標本接種到培養(yǎng)皿上，置于35℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基菌落生長并篩選分離可能的致病菌進行鑒定，且在培養(yǎng)出菌落后，進行藥敏試驗，檢測菌株對相應藥物的敏感性和耐藥性。整個操作過程復雜，耗時較長，要求無菌環(huán)境，需避免外界細菌污染標本或致病菌污染環(huán)境。不同的病原菌適用的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)條件和操作均不同，這就需要操作人員具備扎實的理論知識和專業(yè)熟練的操作技能。培養(yǎng)法是兒童肺炎BALF病原菌檢查方法中最常用的檢測技術(shù)。

BALF培養(yǎng)法檢出病原菌是肺炎病原菌診斷的金標準，在肺炎病原菌診斷中應用最為廣泛長久，具有深厚的實驗研究基礎，且費用不高，是肺炎患兒入院后的基礎檢查。但患兒在取標本前早已使用過抗生素，常導致標本培養(yǎng)陽性率低，且培養(yǎng)法操作復雜，要求嚴格，標本在培養(yǎng)全過程中易受污染，這就對標本取樣合格、培養(yǎng)環(huán)境及操作人員操作技術(shù)具有較高的要求，導致培養(yǎng)法病原菌檢出率低。吳巧等［8］、張小華等［9］、宋衛(wèi)娜等［10］的研究顯示灌洗液培養(yǎng)病原菌檢出率分別為53.3%（32/60）、47.7%（51/107）、21.1%（48/228），吳巧等、張小華等的研究檢出率高于宋衛(wèi)娜等研究的檢出率，這可能與研究的患兒年齡、季節(jié)、區(qū)域及操作過程有關。因部分病原菌難以培養(yǎng)（如鮑特菌、病毒等）和非典型性病原菌（支原體、衣原體等）經(jīng)普通培養(yǎng)方法具有較高的假陰性，導致培養(yǎng)法漏診率較高。且培養(yǎng)法耗時較長，一般細菌培養(yǎng)需24～48 h，結(jié)核分枝桿菌需培養(yǎng)3～4周，很難達到早期快速診斷病原菌的需求。

因BALF培養(yǎng)法從標本取樣到得出結(jié)果大多超過3 d，無法早期快速診斷病原菌，在肺炎早期治療中沒有太多優(yōu)勢，但培養(yǎng)法在培養(yǎng)出菌落后，可在培養(yǎng)基上對菌落進行藥敏試驗，得出菌落對各類抗生素的敏感度和耐藥性，不僅可為病菌耐藥的流行趨勢提供參考依據(jù)，還可為肺炎中期治療抗菌藥物的選擇和調(diào)整提供指導依據(jù)。吳巧等［8］、張小華等［9］、宋衛(wèi)娜等［10］的研究均表明，根據(jù)BALF培養(yǎng)致病菌的種類和藥敏性針對性調(diào)整抗生素使用后，患兒的臨床癥狀和肺部影像學表現(xiàn)均得到好轉(zhuǎn)，治愈率達到84.1%～100.0%，平均住院天數(shù)顯著下降，預后良好。培養(yǎng)法可在治療中期指導調(diào)整抗生素用藥，選擇敏感性較高的藥物針對性治療，不僅可以改善患兒臨床癥狀和預后，減輕患兒的痛苦和家庭經(jīng)濟負擔，還可避免抗生素的濫用，降低耐藥菌株和超級細菌的出現(xiàn)。

2 PCR法在兒童肺炎診治中的應用

PCR法是一種無需分離病毒和細菌或培養(yǎng)細胞，只需利用放大擴增特定的基因片段來檢測臨床標本中的病原菌的檢測方法。因PCR只能應對一對引物，檢測一種致病因子，故臨床上常將其與其他技術(shù)進行整合檢測病原菌?；赑CR原理的多重聚合酶鏈式反應（mPCR），mPCR是在同一PCR反應體系里加入兩對以上引物，可以同時擴增多個核酸片段，可同時檢測多種病原微生物。檢測DNA標本的為基于熒光檢測的定量實時PCR（Q-PCR），檢測RNA標本的為逆轉(zhuǎn)錄定量實時PCR（RT-Q-PCR），臨床上常將多重和實時定量技術(shù)結(jié)合，這體現(xiàn)了高效、簡便、經(jīng)濟的優(yōu)點，但PCR檢測對環(huán)境及儀器設備要求較高，無法區(qū)分定植菌和致病菌［11］。

在肺炎病原菌診斷中，PCR技術(shù)是除培養(yǎng)法外最常用的病原菌檢測方法，能夠在較短的時間內(nèi)檢測出多種致病菌的存在，可顯示肺炎感染病菌是單一感染還是混合感染，且不受抗生素使用的影響，為兒童肺炎病原菌診斷提供了一種快速、敏感的診斷方法［12-13］。PCR利用DNA和RNA片段的擴增，可有效檢測病毒、細菌及支原體等，臨床上常用PCR技術(shù)檢測病毒和支原體，在支原體感染診斷中作用尤為突出，將支原體PCR RNA檢測作為肺炎支原體診斷金標準［14］。GUO等［15］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)多重實時熒光PCR技術(shù)，108例患兒BALF病原菌檢出率為78.7%，其中單一病原體感染檢出率48.1%，多重病原體感染率30.6%。謝樂云等［16］采用熒光定量PCR法檢測的149例肺炎患兒BALF，共檢出病原體129例，其中混合感染23例。BALF PCR檢測病原菌的特異度及敏感度高，具有高檢出率。但PCR局限于需要特定目標基因的優(yōu)先序列數(shù)據(jù)，依賴特定引物的特異度，只能用于已知基因序列的檢測，對未加入病原菌目的基因的病原菌造成漏診，同時PCR技術(shù)無法區(qū)分定植菌和致病菌，亦不能進行藥敏試驗［17］。

PCR技術(shù)因其快速、經(jīng)濟、病原菌檢出率較高的特點，為肺炎早期治療抗菌藥物的選擇提供重要參考依據(jù)，但其無法檢測致病菌對藥物的敏感性和耐藥性，這對早期治療選擇抗生素的使用存在一定的局限性，無法選擇藥敏性較高的藥物進行早期治療，在一定程度上影響肺炎早期治療的療效。通過PCR檢測病原菌，可有效區(qū)分致病菌為病毒、細菌還是支原體，從而有效選擇治療藥物，避免抗生素的濫用。PCR技術(shù)在兒童肺炎治療療效評估中也具有重要的作用，主要表現(xiàn)在支原體感染后治療的療效評估，支原體DNA的FQ-PCR定量檢測通過其拷貝數(shù)來反映支原體感染患兒的病情，使患兒病情評估得到量化，有助于兒童支原體感染尤其是難治性支原體感染的精準診療［18］。但若將PCR與培養(yǎng)法結(jié)合，不僅病菌檢出率增高，還可以檢測菌株的藥敏性［19］，對早期肺炎治療療效具有高效保障。

3 LAMP在兒童肺炎診治中的應用

LAMP是由NOTOMI等于2000年報道［20］的一種新型快速核酸擴增技術(shù)，其原理是通過對目標基因的6個特異區(qū)域設定4種引物，在65℃恒溫條件下依賴一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，生成自我循環(huán)擴增的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，使得目標基因在短時間內(nèi)大量、高效地擴增，無需經(jīng)過模板的加熱變性、長時間溫度循環(huán)、電泳、紫外觀察等過程，僅需1 h即可完成實驗，可用于細菌、非典型性細菌（支原體、衣原體、嗜肺軍團菌）、病毒、真菌、寄生蟲和結(jié)核桿菌的快速診斷。LAMP所需設備簡易，操作簡單，極適用于發(fā)展中國家的病因診斷及傳染病的檢測［21］。

LAMP在小兒肺炎病原菌診斷中常用呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒，利用恒溫擴增芯片技術(shù)檢測呼吸道常見的13種病原菌，包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、嗜肺軍團菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、耐甲氧西林葡萄球菌和結(jié)核分枝桿菌復合群，具有較大的診斷價值。LAMP在診斷病原菌時可在1 h內(nèi)完成檢測實驗，2 h內(nèi)可完成從取樣至出結(jié)果全過程，能夠有效達到早期快速診斷病原菌的目的。LAMP芯片法能從微量拷貝中獲得目的基因，不受抗生素使用的影響，具有較高的檢出率，且LAMP檢測時設定有Tp值，在一定時間內(nèi)擴增拷貝數(shù)達到一定數(shù)量才可判定為陽性，有效區(qū)分定植菌與致病菌，減少假陽性發(fā)生，還可避免交叉反應、免疫抑制狀態(tài)出現(xiàn)假陰性［22-23］。楊雪飛等［24］研究顯示，LAMP病原菌檢出率為56.7%，顯著高于培養(yǎng)的25.0%；研究［25］表明，LAMP比QRT-PCR檢測支原體有更高的敏感性和特異度。LAMP芯片法雖可同時檢測13種常見呼吸道病原菌，但對一些不常見的病原菌造成漏診。但總而言之LAMP芯片法因其耗時短、檢出率高、敏感性高、特異度高及易操作性的優(yōu)點，使得其成為最有前途的即時病原菌診斷方法之一［26］。

LAMP能夠早期快速診斷兒童肺炎病原菌，故對小兒肺炎早期精準靶向治療具有重要參考價值［26］。WANG等［27］根據(jù)LAMP檢測結(jié)果對16例肺炎患兒調(diào)整藥物靶向治療，所有患兒3 d病情好轉(zhuǎn)，緩解率84.2%。楊雪飛等［24］依據(jù)LAMP檢測結(jié)果對肺炎患兒使用抗生素，抗感染治療時間（14.3±2.9）d，住院時間（14.5±3.2）d，均顯著低于初始治療未覆蓋病原體組，而初始治療有效率86.2%高于初始治療未覆蓋病原體組的40.0%。由此可見，LAMP檢測結(jié)果對肺炎患者早期選擇和調(diào)整藥物后的治療療效具有重要意義。雖然LAMP可檢測出部分菌株的耐藥基因，卻存在無法檢測出菌株對藥物的敏感性的局限性，但總體來說LAMP對于多數(shù)的呼吸道感染病原體能夠有效檢出，具有高于培養(yǎng)法和PCR的特異度和敏感性，有效提高了抗生素治療的覆蓋率和針對性，為兒童肺炎早期治療抗生素的使用提供的重要的參考依據(jù)，且有效避免了抗生素的濫用［28］。

4 mNGS在兒童肺炎診治中的應用

mNGS是基于高通量測序技術(shù)主要運用于臨床檢測病原菌的方法，無需培養(yǎng)，能無偏移地將標本中所有病原體的核酸都檢測出來，可有效避免漏檢。高通量測序技術(shù)理論上能檢測所有已知病原體，較其他檢測方法測序通量更高，測序速度更快，可早期、快速、精準鑒定兒童肺炎特別是重癥或難治性肺炎的病原菌。mNGS檢測病原菌種類全面，包括細菌、病毒、真菌、支原體、衣原體、寄生蟲、螺旋體、立克次體，可檢測出常規(guī)手段無法檢測出的病原菌，且能同時檢測出多種病原體與多重感染的情況。

mNGS結(jié)合了高通量測序的陽性率高和宏基因高靈敏度的優(yōu)點，且不受抗生素及厭氧環(huán)境的限制，在12～24 h內(nèi)獲得結(jié)果［29］，提高細菌、病毒、真菌及特殊病原體的檢出率，且能夠有效檢出培養(yǎng)法無法檢測出的病原菌［28］，并能檢測多重感染的情況，為兒童肺炎病原菌診斷尤其是疑難、危重、特殊肺炎病原菌診斷提供快速精準的新方法。柯創(chuàng)宏等［30］發(fā)現(xiàn)，高通量測序法細菌檢出率和敏感度均高于細菌培養(yǎng)法。余世慶等［31］認為，mNGS和恒溫擴增核酸檢測檢出率菌高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，而mNGS檢出率高于LAMP。且在同一BALF標本中，mNGS的特異度及靈敏度高于PCR檢測［32］。但也存在一定的局限性，mNGS能檢測出標本中的所有微生物，故而不能區(qū)分檢出病原菌的性質(zhì)是否為致病性，需臨床醫(yī)生結(jié)合臨床癥狀及實驗室報告和影像學檢查做出判斷，且無法檢測病菌的藥敏性［33］。

mNGS對兒童肺炎的早期治療有著重要的意義，尤其是疑難、危重、特殊肺炎，進行mNGS檢測后，明確致病微生物，及時調(diào)整治療，可有效改善患者的臨床癥狀，縮短平均住院時長，效果優(yōu)于經(jīng)驗性的“廣覆蓋”治療。BALF mNGS檢測敏感性高、確診快，避免了長期使用及濫用抗菌藥物，實現(xiàn)精準治療，從而縮短病程，提高救治成功率。研究顯示，通過mNGS早期明確診斷后，調(diào)整治療方案，患者90 d生存率從57.7%提高至83.3%。

綜上所述，肺炎早期的診療中PCR、LAMP和mNGS占據(jù)重要的位置，能夠早期快速診斷病原菌，及時指導藥物治療，但無法檢測致病菌的藥敏性。mNGS的檢出率雖高于其他檢測方法，但存在費用昂貴，要求技術(shù)水平高，對RNA病毒保存不易，真菌和結(jié)核菌提取DNA相對困難等問題，缺乏統(tǒng)一、完善的檢測流程和質(zhì)量控制標準的局限性。若能盡早建立完善抗生素耐藥基因庫，進一步完善技術(shù)，降低成本，減輕經(jīng)濟負擔，并將mNGS與灌洗液培養(yǎng)、PCR、LAMP進行平行送檢，形成早期快速診斷體系，可為兒童肺炎早期病原菌診斷和早期精準治療做出更完善的參考依據(jù)和指導作用。