方翔永

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定）

0 引言

在有性生殖的過(guò)程中，精子和卵子結(jié)合成受精卵，并攜帶了雙親的遺傳信息，保證了遺傳的穩(wěn)定性。在形成受精卵之前，精子會(huì)發(fā)生頂體反應(yīng)。頂體反應(yīng)（Acrosome reaction, AR）是受精前的重要步驟，并與精子獲能、精卵識(shí)別與融合等[1]過(guò)程相關(guān)。目前，精子發(fā)生頂體反應(yīng)涉及到各種精子膜蛋白，如hSMP 為人類重要的精子膜蛋白，Cheng 等[2]運(yùn)用hSMP 抗體作用于小鼠精子，發(fā)現(xiàn)該抗體可以抑制小鼠的頂體反應(yīng)和精卵結(jié)合過(guò)程。并且頂體反應(yīng)涉及到了多條信號(hào)通路，如泛素-蛋白酶體途徑[3]、磷酸肌醇依賴性途徑[4]等途徑。此外，有研究表明精子發(fā)生頂體反應(yīng)還依賴于Ca2+濃度，并涉及到多條互補(bǔ)的信號(hào)通路[5]。

莠去津（Atrazine）最初是作為一種除草劑，目前也公認(rèn)該物質(zhì)為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，可對(duì)不同物種產(chǎn)生毒性作用，并且其毒性作用體現(xiàn)在不同方面。Aurore 等[6]發(fā)現(xiàn)莠去津能干擾雄性小鼠的精子減數(shù)分裂過(guò)程，Huang 等[7]研究表明莠去津可以破壞DNA 雙鏈的形成。本實(shí)驗(yàn)室在前期主要以中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）為材料，通過(guò)研究中華絨螯蟹精子，揭示出莠去津?qū)又械娜樗崦摎涿负退嵝粤姿崦妇尸F(xiàn)倒“U”形毒性效應(yīng)，即莠去津在中間濃度時(shí)毒性最強(qiáng)[8]。

網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)生物信息學(xué)技術(shù)，通過(guò)檢索毒性物質(zhì)作用靶點(diǎn)和所要作用的組織靶點(diǎn)，并取交集可得到毒性物質(zhì)作用于特定組織的靶點(diǎn)信息。目前，常用的網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)為TOXNET（https://toxnet.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)[9,10]，該數(shù)據(jù)庫(kù)包括了一系列子數(shù)據(jù)庫(kù)，如TOXLINE、CTD、IRIS 等，是目前最全面的網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)的方法，用以揭示出莠去津?qū)τ谌祟惥禹旙w反應(yīng)的毒性作用，探討其作用靶點(diǎn)，并有利于今后通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明莠去津抑制這些靶點(diǎn)，來(lái)探討莠去津?qū)禹旙w反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司采購(gòu)40 只性成熟雄性BALB/c 小鼠，體重約為(30±7)g，并常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 天。

1.1.2 試劑

莠去津，由百靈威科技有限公司提供；M2 受精培養(yǎng)基，由Sigma 公司提供；精子活力試劑盒，由abcam 公司提供；石蠟油，異丙醇，75%乙醇，0.1M PBS 緩沖液，均由上海吉至生化科技有限公司提供；TRIzol 試劑，DEPC 水，Oligo（dT）(10mM)，Reaction Buffer，dNTP Mix，RibolockTM Rnase inhibitor，RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcniptase,RNase Free water，以上試劑均由ThermoFisherScientific 公司；莠去津各作用靶點(diǎn)的上下游PCR 引物，均由上海伯豪生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.3 設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)，由Sigma 公司提供;PCR 儀，由Applied Biosystems 公司提供；Step One TM Software v 2.1 擴(kuò)增儀，由北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司提供；倒置顯微鏡，由Olympus 公司提供。

1.1.4 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件

TOXNET（https://toxnet.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)、CTD 數(shù) 據(jù)庫(kù)（http://ctdbase.org/）、Genecards（https://genecards.weizmann.ac.il/）數(shù)據(jù)庫(kù)、Cytoscape3.2.1、Cytoscape3.2.1 中的ClueGo 插件。

1.2 方法

1.2.1 查詢和篩選莠去津作用靶點(diǎn)

登錄TOXNET 數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇CTD 子數(shù)據(jù)庫(kù)，因TOXNET數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶點(diǎn)信息不全，故需通過(guò)TOXNET 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)入CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)主頁(yè)，選擇“Gene-interaction”子選項(xiàng)，運(yùn)用高級(jí)查詢功能，在“Chemical”項(xiàng)中輸入“Atrazine”，在“Organism”項(xiàng)中輸入“Homo sapiens”，去除重復(fù)靶點(diǎn)信息，得到莠去津作用于人類的靶點(diǎn)信息。

1.2.2 查詢?nèi)祟惥禹旙w反應(yīng)相關(guān)靶點(diǎn)

運(yùn)用Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)，在搜索框中輸入關(guān)鍵詞“Sperm+Acrosome reaction”，得到與人類精子頂體反應(yīng)相關(guān)的靶點(diǎn)信息。運(yùn)用Cytoscape3.2.1 軟件中的ClueGo 插件分析收集到的人類精子頂體反應(yīng)相關(guān)靶點(diǎn)的GO 生物學(xué)過(guò)程和KEGG 代謝通路。

1.2.3 整合靶點(diǎn)信息

將上述收集到的莠去津作用于人類的靶點(diǎn)信息與人類精子頂體反應(yīng)相關(guān)的靶點(diǎn)信息取交集，得到莠去津作用于人類精子頂體反應(yīng)的靶點(diǎn)信息，并整理成Excle 表格。

1.2.4 靶點(diǎn)通路分析

運(yùn)用Cytoscape3.2.1 軟件中的ClueGo 插件對(duì)整合得到的靶點(diǎn)信息進(jìn)行GO 生物學(xué)過(guò)程和KEGG 代謝通路分析，得到這些整合的靶點(diǎn)信息所涉及的生物學(xué)過(guò)程。

1.2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

經(jīng)7 天適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)將小鼠分為空白組、低劑量莠去津組、中劑量莠去津組和高劑量莠去津組，每組各10 只，其中空白對(duì)照組灌胃蒸餾水0.3mL/只，低劑量莠去津組、中劑量莠去津組和高劑量莠去津組分別按照莠去津100mg/kg、200mg/kg 和300mg/kg 的標(biāo)準(zhǔn)配置莠去津溶液，并分別灌胃各莠去津溶液0.3mL，以上各組均處理15 天。

1.2.6 檢測(cè)精子頂體反應(yīng)率[11]

15 天處理完后處死小鼠，并取小鼠附睪末端在37℃下置于0.1M PBS 緩沖液中30min，隨后將附睪置于M2 受精培養(yǎng)基中，配制濃度為5×106精子/mL，于37℃條件下處理2h，并滴加石蠟油，使用精子活力試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)精子活性來(lái)反應(yīng)精子頂體反應(yīng)率。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR 方法檢測(cè)莠去津作用靶點(diǎn)的mRNA 表達(dá)情況

將收集到的小鼠附睪置于液氮中保存，加入1mL TRIzol，離心10min；取 上清，加入 0.2mL 氯仿, 離心15min；取 上清,加入 0.5mL 異丙醇，離心10min；去上清，在沉淀中加入1mL 75 ℅乙醇（DEPC 水配制）,離心5min，去上清，室溫干燥；加入20-50 μL DEPC 水, 促溶，-80℃保存?zhèn)溆茫灰陨细鞑侩x心條件皆為4℃，12000rpm。在保存的樣品中加入總 RNA（質(zhì)量為1ug）、10μM Oligo（dT）1μL，加入DEPC水至12μL，混勻；置于PCR 儀上 65℃，5min，冷卻后加入5×Reaction Buffer 4.0μL、10mM dNTP Mix 2uL、 RibolockTM Rnase inhibitor1μL、RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcniptase1μL；依 次 置 于PCR 儀 上42 ℃，60min、70 ℃，5min，得到cDNA,-80℃保存。取出cDNA，稀釋10 倍，由上下游引物各1uL，cDNA1uL，RNase Free water 2uL 構(gòu)成反應(yīng)體系，其反應(yīng)條件依次為95℃，5min、95℃，2s、60℃，10s，循環(huán)40 次，按2-ΔΔCt公式計(jì)算。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPadPrism8.0.1 軟件繪制莠去津?qū)禹旙w反應(yīng)率影響數(shù)據(jù)的柱狀圖，若P＜0.05 則具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用SPASS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果，該結(jié)果為計(jì)量資料，以±s 表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，若P＜0.05 則具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 通過(guò)查詢CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)，并合并重復(fù)靶點(diǎn)，得到的莠去津作用于人類的靶點(diǎn)信息共有3010 個(gè)。

2.2 通過(guò)查詢Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)得到與人類精子頂體反應(yīng)相關(guān)的靶點(diǎn)共有34 個(gè)，分析GO 生物學(xué)過(guò)程和KEGG 代謝通路，可知這些靶點(diǎn)除了與頂體反應(yīng)相關(guān)外，還涉到精子獲能、精卵識(shí)別與融合等過(guò)程。結(jié)果見(jiàn)表1，通路信息見(jiàn)圖1。

2.3 將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)所收集到的靶點(diǎn)信息取交集，可以得到莠去津作用于人類精子頂體反應(yīng)的靶點(diǎn)為4 個(gè)（DLD、PLCD4、SYT8、TRIM36），這些靶點(diǎn)可為莠去津?qū)θ祟惥禹旙w反應(yīng)毒性作用的關(guān)鍵。其中莠去津作用于DLD、PLCD4 和TRIM36 為抑制作用，SYT8 為促進(jìn)作用。收集到的靶點(diǎn)信息見(jiàn)表2。

2.4 在莠去津處理期間，各組小鼠均能正常飲食飲水，未出現(xiàn)小鼠死亡的現(xiàn)象。

2.5 與空白對(duì)照組相比，其他三組的精子頂體反應(yīng)率明顯低于空白對(duì)照組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；低、中、高劑量莠去津組相互比較發(fā)現(xiàn)，中劑量莠去津組精子頂體反應(yīng)率最低，且與另外兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，符合相關(guān)文獻(xiàn)提到的莠去津倒“U”形毒性效應(yīng)。其結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.6 DLD、PLCD4、SYT8 和TRIM36 的上下游引物序列均由上海伯豪生物技術(shù)有限公司合成，其結(jié)果如 下：DLD 上游為GAGCTGGAGTCGTGTGTACC，下游為 GAACCTATCACTGTCACGTCAG；PLCD4上游為 ATTCAAGACCTACTAGCCACTGA，下游為 CTCCACCAGATAGCGCAACAA；SYT8 上游為GGCCCAGTCTCATCCCAG A， 下游為GATGGCGATAAAGAGGGTCCA；TRIM 36 上游為 CGTTCAATGATGTGGCGTCAG， 下游為GGGTCAGTGAATTACGCTTCC。與空白對(duì)照組相比，其他三組的DLD、PLCD4、TRIM36 的mRNA 表達(dá)量明顯降低，SYT8 的mRNA 表達(dá)量明顯升高，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；低、中、高劑量莠去津組相互比較發(fā)現(xiàn)，中劑量莠去津組DLD、PLCD4 和TRIM36 的mRNA 表達(dá)量最低，SYT8 的mRNA 表達(dá)量最高，且與另外兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，符合倒“U”形毒性效應(yīng)。其結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 人類精子頂體反應(yīng)相關(guān)靶點(diǎn)GO 生物學(xué)過(guò)程和KEGG 代謝通路

表1 人類精子頂體反應(yīng)相關(guān)靶點(diǎn)信息

續(xù)表1

表2 莠去津作用于人類精子頂體反應(yīng)靶點(diǎn)信息

表3 莠去津?qū)π∈驞LD、PLCD4、SYT8 和TRIM36 的mRNA 表達(dá)量的影響

圖2 莠去津?qū)π∈缶禹旙w反應(yīng)率的影響

3 討論

生物的有性生殖過(guò)程涉及到精卵識(shí)別與結(jié)合的過(guò)程，在發(fā)生該過(guò)程前，精子需要發(fā)生頂體反應(yīng)，以期獲得足夠的能量。在發(fā)生頂體反應(yīng)前，精子需要通過(guò)獲能的步驟達(dá)到頂體反應(yīng)發(fā)生的必要條件，但主要發(fā)生在哺乳動(dòng)物中，近期有研究認(rèn)為非哺乳動(dòng)物發(fā)生頂體反應(yīng)無(wú)需精子獲能[12]。本課題組主要研究的實(shí)驗(yàn)材料為中華絨螯蟹，不屬于哺乳類動(dòng)物，可推測(cè)精子獲能不是中華絨螯蟹發(fā)生頂體反應(yīng)的必要條件，在今后研究中華絨螯蟹頂體反應(yīng)時(shí)不受精子是否獲能影響。目前關(guān)于莠去津影響精子頂體反應(yīng)的研究缺乏，本研究主要通過(guò)網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)來(lái)發(fā)現(xiàn)莠去津如何影響頂體反應(yīng)進(jìn)程，并發(fā)現(xiàn)其作用靶點(diǎn)，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)莠去津作用于精子頂體反應(yīng)為以下4 個(gè)靶點(diǎn)：二氫硫辛酰胺脫氫酶(Dihydrolipoamide Dehydrogenase,DLD)、 磷 脂 酶Cδ4(Phospholipase C Delta 4,PLCD4)、突觸受體8(Synaptotagmin 8,SYT8) 和三方基序包含蛋白36(Tripartite Motif Containing 36,TRIM36)，其中莠去津能抑制DLD、PLCD4 和TRIM36 基因表達(dá)，促進(jìn)SYT8 基因表達(dá)。通路分析結(jié)果顯示，這些靶點(diǎn)涉及的通路為頂體反應(yīng)，表明這些靶點(diǎn)主要作用于頂體反應(yīng)本身，對(duì)于精子獲能、精卵識(shí)別等相關(guān)過(guò)程影響較小。

DLD 是形成丙酮酸脫氫酶體系的一種前體物質(zhì)，可參與三羧酸循環(huán)過(guò)程。Sharmila 等[13]研究表明DLD 可與二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(dihydrolipoamide acetyltransferase,E2)的結(jié)合域作用，可為E2 的脂酰結(jié)構(gòu)域可移動(dòng)到該復(fù)合物中，形成重要的多酶體系。目前，有些研究報(bào)道稱DLD 表達(dá)缺失可導(dǎo)致血漿瓜氨酸升高[14]、急性肝衰竭復(fù)發(fā)[15]等表現(xiàn)，說(shuō)明DLD 靶點(diǎn)與多種病理過(guò)程相關(guān)。目前文獻(xiàn)中關(guān)于DLD 與頂體反應(yīng)的關(guān)系報(bào)道較少，Vivek 等[16]以倉(cāng)鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)DLD、活性氧（ROS）、cAMP 和Ca2+在倉(cāng)鼠精子的頂體反應(yīng)必不可少，抑制DLD 可減少活性氧產(chǎn)生和cAMP 水平，并進(jìn)一步導(dǎo)致頂體反應(yīng)功能減退。

PLCD4 可參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用。該物質(zhì)由Liu[17]首次報(bào)道，為誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)入S 期的新物質(zhì)，其定位與細(xì)胞核上。Marianna 等[18]以人間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)將PLCD4 基因敲除可增加G1 期細(xì)胞和減少間期及G2/M 期細(xì)胞比例，并且PLCD4 基因未敲除的干細(xì)胞其衰老細(xì)胞比例較高，表明該靶點(diǎn)可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與衰老過(guò)程。PLCD4 在精子頂體反應(yīng)發(fā)生過(guò)程中，也是一種不可或缺的成分。Fukami 等[19]研究了多種磷脂酶C 亞型在哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PLCD4 在表達(dá)上處于優(yōu)先地位，在透明帶誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)中必不可少。

SYT8 為莠去津作用的4 個(gè)靶點(diǎn)中唯一一個(gè)促進(jìn)其表達(dá)的靶點(diǎn)，屬于膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白大家族，在神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞中均有表達(dá)，但靶點(diǎn)不作為Ca2+傳感器，具有無(wú)Ca2+ 敏感的可溶性[20]。SYT8 作為一種突觸受體，可參與SNARE 蛋白介導(dǎo)的膜泡運(yùn)輸過(guò)程和胞吐作用。SNARE蛋白即可溶性的N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein attachment protein receptor)為一大類膜蛋白家族，主要通過(guò)形成SNARE 蛋白復(fù)合體，在膜融合和物質(zhì)運(yùn)輸中有重要作用。在人類精子頂體反應(yīng)中，SNARE 蛋白起著不可或缺的作用[21]。通過(guò)以上研究可推測(cè)莠去津作用于SYT8 靶點(diǎn)可間接通過(guò)SNARE 蛋白影響精子的頂體反應(yīng)過(guò)程。

TRIM36 為三方基序包含蛋白成員之一，該類蛋白家族與腫瘤關(guān)系較密切，目前已有多篇關(guān)于兩者關(guān)系的報(bào)道，如TRIM25 可促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展[22]、TRIM29 與胃癌的關(guān)系[23]等。Man 等[24]報(bào)道稱TRIM36 基因高表達(dá)能夠提高胃癌放療患者的總體生存率，表明該靶點(diǎn)為放療治療胃癌的重要靶點(diǎn)，可能為胃癌放療敏感性的潛在靶點(diǎn)。目前研究TRIM36 與精子頂體反應(yīng)的關(guān)系無(wú)專門的文獻(xiàn)報(bào)告，僅有Hering 等[25]通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析研究公牛的精子運(yùn)動(dòng)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)TRIM36與精子運(yùn)動(dòng)有關(guān)，故研究TRIM36 與精子頂體反應(yīng)的關(guān)系具有較大意義。

綜上所述，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)莠去津可通過(guò)DLD、PLCD4、SYT8 和TRIM36 這4 個(gè)靶點(diǎn)對(duì)精子頂體反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生影響，其中莠去津?qū)LD、PLCD4 和TRIM36 起抑制作用，對(duì)SYT8 起促進(jìn)作用。通過(guò)GO 生物學(xué)過(guò)程和KEGG代謝通路分析，可以發(fā)現(xiàn)上述靶點(diǎn)作用的生物學(xué)過(guò)程為頂體反應(yīng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)方法具有一定的可靠性。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，莠去津可降低頂體反應(yīng)率，對(duì)精子的頂體反應(yīng)有抑制作用，并且可使DLD、PLCD4 和TRIM36 的mRNA 表達(dá)量降低，SYT8 的mRNA 表達(dá)量升高，且中劑量莠去津組尤為明顯，符合文獻(xiàn)中所提高的倒“U”形毒性效應(yīng)。本研究?jī)H以人類精子頂體反應(yīng)過(guò)程的相關(guān)信息，并輔以小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，對(duì)于中華絨螯蟹等非哺乳類動(dòng)物是否準(zhǔn)確有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。