陳寶峰,顧陽,王寶石,常景玲,張中華,李志剛

（1.河南省現(xiàn)代生物育種協(xié)同創(chuàng)新中心,河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學院生命科技學院,河南新鄉(xiāng)453003）

環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）是一種廣泛存在于動物、植物及微生物中的生理活性物質,被稱為“第二信使”,廣泛參與生物體內(nèi)糖代謝、脂肪代謝以及核酸和蛋白質合成等重要生命活動[1].該物質能夠作為植物生長調節(jié)劑和飼料添加劑廣泛應用于農(nóng)作物和畜禽產(chǎn)品的生產(chǎn)中,具有十分重要的應用價值[2-3].

目前,cAMP 的生產(chǎn)方法主要有化學法、酶法、微生物發(fā)酵法.微生物發(fā)酵法相對于其他兩種制備方法具有生產(chǎn)易放大、產(chǎn)物純度高、環(huán)境污染少等優(yōu)點,能夠滿足當前經(jīng)濟社會發(fā)展的需要,受到越來越多的關注[4].然而,微生物發(fā)酵法生產(chǎn)cAMP 過程中存在著一些問題嚴重制約著其產(chǎn)量的提高.一方面,在cAMP 從頭合成過程中嘌呤環(huán)的合成需要天冬氨酸（Asp）、谷氨酰胺（Gln）、甘氨酸（Gly）等前體氨基酸的參與[5],由于菌體自身代謝調控機制的作用,使得這些前體氨基酸的含量很低,不能滿足cAMP 持續(xù)合成的需要[6].另一方面,微生物內(nèi)氨基酸不僅用于產(chǎn)物的合成,還要用為自身的生長和其它代謝活動正常運轉提供充足供應.因此,氨基酸的含量成為限制cAMP 高產(chǎn)的關鍵因素.有關研究表明,通過外源添加氨基酸能夠有效提高某些產(chǎn)物的發(fā)酵性能.例如,在腺苷發(fā)酵生產(chǎn)中,適量添加谷氨酸能夠有效提高腺苷的發(fā)酵性能,使得腺苷的產(chǎn)量提高30%以上[7].在S-腺苷-L-蛋氨酸高密度發(fā)酵過程中,適量補加前體L-蛋氨酸能顯著促進S-腺苷-L-蛋氨酸的積累[8].因此,為進一步提高cAMP 的發(fā)酵性能,擬采用適量添加外源氨基酸的方式,在搖瓶培養(yǎng)條件下通過設計正交試驗優(yōu)化出Asp、Gln、Gly 的最適添加條件,并經(jīng)過發(fā)酵罐試驗驗證,以此來探究添加不同前體氨基酸對環(huán)磷酸腺苷發(fā)酵性能的影響.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種 篩選節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）A.sp01,保藏于中國典型培養(yǎng)物保存中心,保藏號為CCTCC No.M2013431.

1.1.2 培養(yǎng)基成分和其他試劑 斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10 g,蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,NaCl 3 g,尿素4 g,瓊脂20 g,調節(jié)pH 值至7.2,121 ℃、高壓蒸汽滅菌20 min.

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g,蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,NaCl 3 g,尿素4 g,酵母膏10 g,調節(jié)pH 值至7.2,121 ℃、高壓蒸汽滅菌20 min.

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g,K2HPO410 g,KH2PO410 g,尿素10 g,生物素0.005 g,CoCl20.01 g,蛋白胨5 g,次黃嘌呤2 g,調節(jié)pH 值至7.2,121 ℃、高壓蒸汽滅菌20 min.

L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸均購自天津市光復精細化工研究所；試驗所用試劑均為分析純.

1.1.3 儀器LDZX-50KBS 高壓滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD 雙人垂直凈化工作臺,蘇凈集團安泰公司制造；ZWF-2112 搖床,上海智城分析儀器制造有限公司；UV-2800 紫外分光光度計,上海舜宇恒平科學儀器有限公司；BIOTECH-7BG 機械攪拌式發(fā)酵罐,上海保興生物設備有限公司；Aglient 1260 Infinity 液相色譜儀,美國安捷倫科技有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 搖瓶培養(yǎng)：250 mL 錐形瓶裝30 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基,121 ℃、高壓蒸汽滅菌20 min.接入培養(yǎng)24 h 的種子液,接種量體積分數(shù)為10%.搖床培養(yǎng)72 h,培養(yǎng)溫度30 ℃、轉速220 r/min.

發(fā)酵罐培養(yǎng)：7 L 機械攪拌式發(fā)酵罐配備pH 計和DO 電極，裝有初始葡萄糖質量濃度為80 g/L 發(fā)酵培養(yǎng)基5 L,121 ℃、高壓蒸汽滅菌20 min,接種量10%,發(fā)酵溫度30 ℃,pH 控制在6.8,初始攪拌轉速為400 r/min、通風量起始為0.1 m3/（m3/min）,隨后視溶氧變化情況逐漸調節(jié).

氨基酸添加方法：

a.發(fā)酵罐試驗.發(fā)酵進行至27 h,脈沖式添加Asp 質量濃度0.2 g/L、Gly 質量濃度1.0 g/L、Glu 質量濃度4.0 g/L.

b.單因素搖瓶試驗.設置質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L 五個水平的L-天冬氨酸.設置質量濃度為2、3、4、5、6 g/L 五個水平的L-谷氨酸.設置質量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L 五個水平的L-甘氨酸.每個水平均設3 個重復.

c.正交試驗.考慮到三種氨基酸之間的交互作用,在單因素試驗結果的基礎上,以cAMP 的產(chǎn)量為評價指標,每種氨基酸設置三個質量濃度水平,設計三因素三水平正交試驗,優(yōu)化獲得最優(yōu)的氨基酸添加方式,并以此作為發(fā)酵罐的添加條件.每個組合做三次重復試驗,正交試驗的因素水平如表1 所示.

表1 因素水平表Tab. 1 Table of the factorial experiment g/L

1.2.2 分析方法 菌體質量濃度測定：采用光密度法測定,發(fā)酵液稀釋20 倍,用600 nm 波長下的OD 值表示菌體質量濃度[9].

葡萄糖質量濃度測定：采用DNS 法進行測定[10].

cAMP 與次黃嘌呤測定：采用高效液相色譜進行測定[11].

2 結果與分析

2.1 天冬氨酸適宜添加量的確定

cAMP 嘌呤環(huán)結構中第1 位氮來自Asp 的α-氨基,因此優(yōu)化Asp 質量濃度有助于提高菌體從頭合成的產(chǎn)苷量.本研究首先在搖瓶上篩選出Asp 的最優(yōu)添加質量濃度,并以此作為正交試驗的試驗依據(jù).由于前期分批發(fā)酵數(shù)據(jù)顯示次黃嘌呤質量濃度在27 h 基本不變[12],又結合搖瓶的生長特性確定添加時間為30 h.以cAMP 的產(chǎn)量作為選取最適添加質量濃度的標準,如圖1 所示：與空白相比,添加Asp 能夠提高cAMP 的產(chǎn)量,同時在一定范圍內(nèi),cAMP 的產(chǎn)量隨Asp 的質量濃度的增加而增大,但當達到一定質量濃度之后,cAMP 質量濃度都呈現(xiàn)下降趨勢.因此,確定Asp 的適宜添加質量濃度為0.2 g/L.

圖1 添加天冬氨酸對cAMP 發(fā)酵生產(chǎn)的影響Fig. 1 The effect of aspartic acid addition on cAMP biosynthesis

2.2 谷氨酸適宜添加量的確定

cAMP 嘌呤環(huán)結構中第3 位氮及第9 位氮來自于Gln 的酰胺基,因此優(yōu)化Gln 質量濃度能夠促進cAMP 的合成.在實際生產(chǎn)中,由于谷氨酰胺性質不穩(wěn)定,容易分解失活[13],而生物體內(nèi)的Gln 是Glu 可以經(jīng)谷氨酰胺合成酶催化生成,并且谷氨酸性質穩(wěn)定,來源廣泛,便于大規(guī)模工業(yè)使用.因此,可以選用Glu替代Gln 作為添加氨基酸.如圖2 所示：當Glu 質量濃度在2～4 g/L 時,cAMP 質量濃度逐漸升高,當質量濃度為4 g/L 時,cAMP 質量濃度達到最高；隨后,當繼續(xù)提高谷氨酸質量濃度,cAMP 質量濃度不增反降.因此,選取質量濃度為4 g/L 作為谷氨酸的適宜添加量.

圖2 添加谷氨酸對cAMP 發(fā)酵生產(chǎn)的影響Fig. 2 The effect of glutamic acid addition on cAMP biosynthesis

2.3 甘氨酸適宜添加量的確定

嘌呤環(huán)中第4 位、第5 位碳和第7 位氮則來自甘氨酸,因此優(yōu)化Gly 的含量將有助于cAMP 的合成.如圖3 所示,共設置5 個質量濃度分別為0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L 和2.5 g/L 的Gly.隨著Gly 質量濃度的增大,cAMP 質量濃度逐漸增大,當Gly 質量濃度為1.5 g/L 時,cAMP 質量濃度達到最大2.37 g/L,隨后繼續(xù)增大Gly 質量濃度,cAMP 發(fā)酵質量濃度不增反降.因此,確定質量濃度1.5 g/L 為Gly 適宜的添加條件.

圖3 添加甘氨酸對cAMP 發(fā)酵生產(chǎn)的影響Fig. 3 The effect of glycin addition on cAMP biosynthesis

2.4 正交試驗確定前體氨基酸適宜添加條件

在獲得單個氨基酸適宜添加質量濃度的基礎上,進一步優(yōu)化得到最佳的氨基酸添加組合.采用三因素三水平正交試驗,通過對三種氨基酸的最優(yōu)添加質量濃度進行適當?shù)卣{整,設計了該正交試驗.由表2結果分析可知,三種氨基酸中影響菌體產(chǎn)苷的主次關系為：Gly＞Glu＞Asp.三種氨基酸添加的適宜組合為A2B1C2,即Asp 質量濃度為0.2 g/L,Gly 質量濃度為1.0 g/L,Glu 質量濃度為4.0 g/L.進一步對試驗結果進行方差分析,分析結果如表3 所示,三種氨基酸對菌體產(chǎn)苷的影響均不顯著,分析原因可能是由于正交試驗中存在較大誤差,且各項自由度較小,從而使檢驗的靈敏度較低,掩蓋了考察因素的差異顯著性.綜上所述,選取最優(yōu)的氨基酸組合A2B1C2作為氨基酸添加方式,進行7 L 發(fā)酵罐試驗.

表2 正交試驗設計與結果Tab. 2 Orthogonal array design and results

表3 正交試驗方差分析表Tab. 3 Variance analysis for the orthogonal results

2.5 添加氨基酸提高環(huán)磷酸腺苷發(fā)酵性能

在7 L 發(fā)酵罐上進行了添加與不添加氨基酸的發(fā)酵試驗,探究氨基酸對cAMP 發(fā)酵的影響.依照正交試驗的優(yōu)化結果,在發(fā)酵27 h,脈沖式添加Asp 質量濃度為0.2 g/L,Gly 質量濃度為1.0 g/L,Glu 質量濃度為4.0 g/L.如圖4b 所示,培養(yǎng)基內(nèi)次黃嘌呤在發(fā)酵27 h 基本完全反應,質量濃度維持在0.4 g/L 左右,說明此后cAMP 經(jīng)從頭合成途徑生成.添加氨基酸鹽發(fā)酵批次,在發(fā)酵60 h 時cAMP 的產(chǎn)量質量濃度達到3.35 g/L,相比于對照批次發(fā)酵72 h 時cAMP 質量濃度為3.32 g/L；產(chǎn)量提高并不顯著.然而,發(fā)酵時間縮短了12 h,相對于對照批次生產(chǎn)效率提高了21.7%.在一定程度上,添加氨基酸促進了菌體生長并提高了cAMP 的合成能力,如圖4（a,c）所示.值得注意的是,添加氨基酸鹽促進了葡萄糖的消耗,說明cAMP 從頭合成過程能量消耗較大,加劇了微生物對能源物質的需求.

圖4 添加前體氨基酸對cAMP 發(fā)酵性能的影響Fig. 4 The cAMP fermentation performance with amino acids mixture addition

3 結論

通過單因素與正交試驗得到了cAMP 發(fā)酵的最優(yōu)氨基酸添加組合：Asp 質量濃度為0.2 g/L、Gly 質量濃度為1.0 g/L 和Glu 質量濃度為4.0 g/L.利用搖瓶進行發(fā)酵試驗,cAMP 的產(chǎn)量提高了109.15%.在7L發(fā)酵罐上進行驗證結果表明,與對照批次相比,脈沖式添加氨基酸混合液發(fā)酵時間縮短了12 h,生產(chǎn)效率提高了21.7%.搖瓶與發(fā)酵罐實驗結果表明添加氨基酸混合液能夠提高cAMP 的發(fā)酵性能.