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人工冬蟲夏草對特發(fā)性肺纖維化上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中信號通路的影響

2021-01-13 12:58黃鶯徐芳袁文勝
世界中醫(yī)藥 2021年24期
關(guān)鍵詞:肺纖維化纖維細胞質(zhì)粒

黃鶯 徐芳 袁文勝

摘要 目的:觀察肺纖維化動物模型中人工冬蟲夏草(Ccs)是否通過TGFbeta1-Smad途徑來影響肺間質(zhì)纖維化上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。方法:將50只SD大鼠隨機分為空白對照組、博來霉素組(BLM組)、博來霉素+冬蟲夏草組(Ccs組)、空白質(zhì)粒組、siRNA組(Smad3siRNA+博來霉素+冬蟲夏草),采用氣管內(nèi)注入博來霉素(5 mg/kg)復(fù)制大鼠肺纖維化模型,對照組給予生理鹽水1.25 mL/kg。Ccs組于造模當日開始灌胃人工冬蟲夏草溶液5 g/(kg·d),空白質(zhì)粒組于造模第二天進行空白質(zhì)粒尾靜脈快速注射(3 mL/kg)。siRNA組在每天Ccs灌胃基礎(chǔ)上于造模次日尾靜脈注射Smad3 siRNA質(zhì)粒(3 mL/kg)。于第28天處死動物。行HE染色,并用RT-PCR檢測肺組織勻漿中上皮細胞標志物E-cad、間皮細胞標志物α-SMA以及信號通路相關(guān)分子Smad3、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、結(jié)締組織生長因子(CTGF)的mRNA的蛋白表達變化。結(jié)果:BLM組纖維化程度較重,Ccs組炎癥程度明顯減輕,纖維組織大量減少,siRNA組同Ccs組比較肺泡炎及纖維化程度有所加重;RT-PCR結(jié)果顯示BLM組TGF-β1、α-SMA表達較對照組明顯增高,siRNA組的α-SMA、CTGF表達較Ccs組有顯著上升。結(jié)論:Ccs可能通過阻斷TGFbeta1-Smad信號通路抑制肺纖維化的發(fā)生。

關(guān)鍵詞 成纖維細胞;表型轉(zhuǎn)化;TGFbeta1-Smad信號通路;人工冬蟲夏草,肺間質(zhì)纖維化;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)化生長因子;博來霉素

Abstract Objective:To observe the effects of cultured cordyceps sinensis(cultured cordyceps Sinensis,Ccs) in the animal model of pulmonary fibrosis induced by bleomycin(BLM) on pulmonary interstitial fibrosis by TGFbeta1-Smad pathway,and explore the mechanism of treating pulmonary fibrosis.Methods:A total of 50 rats were randomly divided into a blank control Group 10,a bleomycin Group(BLM) 10,a bleomycin and Cordyceps sinensis Group(Ccs) 10,a blank plasmid Group 10,Smad3 SiRNA gene silencing rat+bleomycin mildew element+cordyceps sinensis Group(Smad3 siRNA+BLM+CCS) 10.tracheotomy injected bleomycin(5 mg) was used to replicate mouse pulmonary fibrosis model,the control group was given saline 1.25 mL/kg.Ccs Group on the day of the modelling began to stomach artificial cordyceps sinensis solution 5 g/(kg·d),the blank plasmid group in the second day of the model for the rapid injection of empty particles of the tail vein(3 mL/kg).The Smad3 siRNA+BLM+CCS group was injected into the Smad3 siRNA plasmid(3 mL/kg) at the end of the day after the injection of CCS on a daily basis.The animals were executed on the 28th day.In the left lung tissue,hematoxylin-eosin(HE) staining was used to observe the degree of alveolar inflammation and pulmonary fibrosis,and the right lung was detected by RT-PCR to detect the E-cad of the upper and middle skin cells of lung homogenate,the α-SMA intercellular markers and the signaling pathway related molecular Smad3,TGF-β1,CTGF Changes in the expression of mRNA protein.Results:In BLM Group,the degree of fibrosis was heavy,the degree of inflammation in the CCS group decreased markedly,the fibrous tissue was greatly reduced,and the degree of alveolar inflammation and fibrosis in Smad3 SiRNA+BLM+Ccs group was worse than that in CCS group.The results of RT-PCR showed that TGF-β1 and α-SMA expression in BLM group increased significantly The expression of α-SMA,and CTGF in SiRNA+BLM+CCS group increased significantly compared with that in CCS group.Conclusion:CCS may inhibit the occurrence of pulmonary fibrosis by blocking the TGFbeta1-Smad signaling pathway and reduce the effect of pulmonary fibrosis by inhibiting the activation of the TGFbeta1-Smad signaling pathway.

Keywords Fibroblast; Transit; TGFbeta1-Smad signaling pathway; Cultured cordyceps sinensis; Pulmonary fibrosis; Epithelial-interstitial transformation; Transforming growth factor; Bleomycin

中圖分類號:R282文獻標識碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2021.24.008

肺纖維化(PF)是一種原因不明且持續(xù)性進展的疾病,目前尚無特效治療藥物。國內(nèi)外研究表明,肺成纖維細胞的增殖、轉(zhuǎn)化是其發(fā)生機制的關(guān)鍵。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)被認為是成纖維細胞的一個重要來源[1-2]。近年來研究顯示,TGFbeta1-Smad信號通路與肺纖維化發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3-4]。而人工冬蟲夏草能抑制α-SMA、TGF-β的表達[5-6]。因此推測人工冬蟲夏草能通過阻斷TGFbeta1-Smad信號通路,延緩肺纖維化的發(fā)展[7-8]。本實驗通過博來霉素(bleomycin,BLM)復(fù)制肺纖維化動物模型,觀察Smad3、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1對α-SMA、E-cad的表達的影響,并用人工冬蟲夏草(Ccs)進行干預(yù),探索中藥Ccs治療肺纖維化的作用機制,為肺纖維化的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取50只雄性SD大鼠,體質(zhì)量200~300 g(濟南朋悅實驗大鼠繁育有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(魯)20140007),大鼠于SPF級環(huán)境中飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度24~26 ℃,相對濕度50%~60%,保證飲食充足,12 h光照,12 h黑暗循環(huán),自由飲水、進食。動物實驗獲本院倫理委員會批準(倫理審批號:2018003)。

1.1.2 藥物 博來霉素4 mg/支(哈爾濱博萊制藥有限公司,批號:20170411);人工冬蟲夏草(Cultured Cordyceps Sinensis,Ccs)(杭州中美華東公司,批號:2106306C)配置濃度為1.25 g/mL。

1.1.3 試劑與儀器 Smad3 siRNA質(zhì)粒構(gòu)建均由上海生物工程有限公司合成,批號:20170516;TGF-β、Smad3、E-cad、α-SMA、CTGF鼠單克隆一抗和兔抗鼠二抗(Abcam公司,美國,批號分別為:20170112、20170230、20170225、20170311、20170412、20170612、20170212、20170133、20170231、20170742);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司,貨號:CW0741S)、RT-PCR試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司,貨號分別為:CW07425);HRP標記二抗(武漢博士德生物工程有限公司,貨號:BA1054),引物由上海生物工程有限公司合成。全自動生化分析儀(迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司,型號:CS-6400);光學(xué)顯微鏡(Olympus公司,日本,型號:CX43);醫(yī)用離心機(湖南湘儀離心機有限公司,型號:LA500)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將50只SD大鼠隨機分為空白對照組10只、博來霉素組(BLM組、模型組)10只、博來霉素+冬蟲夏草組(Ccs組)10只、空白質(zhì)粒組10只、Smad3 siRNA基因沉默大鼠(尾靜脈注射Smad3 siRNA表達質(zhì)粒)+博來霉素+冬蟲夏草組(siRNA組)10只,分別于28 d處死大鼠。每組大鼠用4%水合氯醛(0.01 mL/g)行腹腔注射麻醉,麻醉后固定于手術(shù)臺上,暴露氣管后于氣管內(nèi)注藥。除對照組外其余組注入博來霉素(5 mg/kg),空白對照組氣管內(nèi)注入生理鹽水(1.25 mL/kg)制造陰性對照。

1.2.2 給藥方法 空白質(zhì)粒組于造模第2天進行空白質(zhì)粒尾靜脈快速注射(3 mL/kg)。Ccs組于造模當天開始每天用Ccs溶液灌胃(0.6 g/kg·d),siRNA組在每天Ccs灌胃基礎(chǔ)上于造模次日尾靜脈注射Smad3siRNA質(zhì)粒(3 mL/kg)。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 肺組織病理學(xué)觀察 大鼠肺組織用HE染色以及免疫組織化學(xué)法制成5 μm厚的石蠟切片。然后用蘇木精對細胞核進行染色,時長3 min,經(jīng)過流水洗、鹽酸乙醇分化、再流水洗、氨水返藍30 s,最后蒸餾水洗,在顯微鏡下觀察切片染色情況。隨后用伊紅對細胞質(zhì)進行染色,時長15 s。染色后再經(jīng)過梯度乙醇進行脫水、二甲苯透明以及中性樹膠封片。最后在顯微鏡下觀察肺間質(zhì)厚度以及肺纖維化的程度。

1.2.3.2 RT-PCR檢測E-cad、α-SMA、TGF-β1、CTGF的mRNA表達 用Trizol法提取總RNA。所有標本取相同質(zhì)量的RNA,然后通過逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,最后用RT-PCR方法進行檢測。反應(yīng)體系中的引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。通過方差齊性檢測后采用兩獨立樣本t檢驗;如方差不齊性,采用Manna-Whitney U檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織病理學(xué)改變 在空白對照組中,肺組織切片HE染色后發(fā)現(xiàn),肺泡間隔基本正常,肺泡連續(xù)性完整,肺泡直徑和面積比較均勻,大部分終末小氣道和血管周邊沒有明顯炎癥細胞浸潤,有個別區(qū)域的終末小氣道管壁可見增厚及少許炎癥細胞浸潤,組織中未發(fā)現(xiàn)纖維化改變。模型組和空白質(zhì)粒組中可見肺泡間隔增寬,肺泡連續(xù)性均受到破壞,肺泡直徑和面積大小變得不均勻,而終末小氣道附近炎癥細胞明顯浸潤,在血管周邊也看到較多炎癥細胞浸潤的改變。同時可以看到肺纖維化已形成,特別是支氣管周邊肺纖維化改變較為明顯,外周部分區(qū)域也可以看到局灶性纖維化改變。Ccs組與BLM組比較,肺組織和結(jié)構(gòu)均較完整,其炎癥細胞浸潤明顯減少,大鼠肺泡腔內(nèi)可見殘留少許炎癥細胞,肺泡間隔縮小顯著,纖維樣改變組織明顯減少。siRNA組與Ccs組比較,肺泡炎及纖維化程度有所加重。見圖1。

2.2 各組E-cad、TGF-β、Smad3、α-SMA、CTGFmRN比較 BLM組及空白質(zhì)粒組TGF-β、Smad3、α-SMA、CTGFmRN表達較對照組明顯增高(P<0.05),E-cad的表達較對照組明顯減低(P<0.05)。siRNA組α-SMA、TGF-β表達較Ccs組有顯著上升(P<0.05),E-cad的表達較Ccs組明顯減低(P<0.05)。見表2。

3 討論

冬蟲夏草是一種真菌和昆蟲的復(fù)合體。寄生的真菌就是冬蟲夏草菌[Cordyceps Sinensis(BerK.)Sacc.],被寄生的蟲體是蟲草蝙蝠蛾的幼蟲。現(xiàn)代研究表明,冬蟲夏草具有保護腎臟,可以通過抗炎、抗氧化等作用,對人體多臟器包括腎、肝、肺以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮功效,特別是在抗纖維化方面的作用得到多方面的認可。人工冬蟲夏草的蟲草菌粉為冬蟲夏草無性型發(fā)酵菌粉,與天然蟲草有相似的化學(xué)成分和藥理作用[9]。有研究表明,人工冬蟲夏草可下調(diào)TGF-β1-Smad信號通路的下游效應(yīng)因子如VEGF、CTGF、MMP-2等表達,抑制上皮細胞向成纖維細胞(MF)轉(zhuǎn)化從而延緩肺纖維化的進展[10-12]。

本實驗中,Ccs組的E-cad表達較BLM組顯著增高,而α-SMA則明顯減少,表示人工冬蟲夏草抑制了成纖維細胞的增殖,減少上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化,從而減輕肺纖維化的發(fā)生。siRNA組較Ccs組的TGF-β1及α-SMA表達均減少,表示人工冬蟲夏草能通過阻斷Smad3-TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,減少了TGF-β1的表達,使成纖維細胞增殖減少,達到阻礙肺纖維化發(fā)展的目的[13-15]。

siRNA組中CTGF的表達較Ccs組減少,表明Ccs對Smad3-TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游因子起到了抑制作用,影響CTGF與TGF-β1結(jié)合,進一步抑制細胞外基質(zhì)合成的作用。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是近年來有關(guān)肺成纖維細胞來源的研究熱點,TGF-β1已被證實是誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要因子[16-18]。而人工冬蟲夏草對肺纖維化的保護性作用是一直得到認可的[19-20]。在本實驗中,Ccs可能通過阻斷Smad3-TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,減少TGF-β的表達,并通過阻斷該信號通路,減少CTGF的表達,進一步抑制上皮細胞向成纖維細胞轉(zhuǎn)化,從而延緩肺纖維化的進展。

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(2020-01-17收稿 責(zé)任編輯:張雄杰)

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