董乃雋 尹侃 李霄霞 李寧 侯琳 趙春華

[摘要] 目的 探討使用不同方法分離提取的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADMSCs）是否存在細(xì)胞生物學(xué)活性的差異。

方法 分別使用直接消化法和干細(xì)胞基質(zhì)膠消化法分離提取ADMSCs，進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定、增殖活性檢測，應(yīng)用Real-time PCR方法檢測誘導(dǎo)分化后成脂標(biāo)志基因過氧化物酶體激活受體γ（PPAR-γ）和成骨標(biāo)志基因runt轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX-2）mRNA的表達(dá)，Western blot方法檢測PPAR-γ和RUNX-2蛋白表達(dá)。

結(jié)果 基質(zhì)膠消化法得到的ADMSCs相較于直接消化法得到的ADMSCs在培養(yǎng)第3天的增殖活力更高（F=727.139，P<0.05）。與直接消化法比較，成脂誘導(dǎo)分化6～12 d后基質(zhì)膠消化法得到ADMSCs的PPAR-γ mRNA表達(dá)增高（F=40.260～157.532，P<0.05），PPAR-γ蛋白表達(dá)在誘導(dǎo)分化6 d后增高（F=1 501.475，P<0.05）;成骨誘導(dǎo)分化3～12 d基質(zhì)膠消化法得到ADMSCs的RUNX-2 mRNA表達(dá)較直接消化法增高，誘導(dǎo)分化3 d蛋白表達(dá)增高（F=58.018～2 402.049，P<0.05）。

結(jié)論 使用基質(zhì)膠消化法得到的ADMSCs成脂、成骨分化潛力優(yōu)于直接消化法。

[關(guān)鍵詞] 間質(zhì)干細(xì)胞;脂肪組織;成脂分化;成骨分化

[中圖分類號(hào)] R329.24

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2021）06-0791-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.145

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210706.1547.005.html;2021-07-07 09：47：34

EFFECTS OF DIFFERENT EXTRACTION METHODS ON THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF HUMAN ADIPOSE-DERIVED

MESENCHYMAL STEM CELLS

DONG Naijun， YIN Kan， LI Xiaoxia， LI Ning， HOU Lin， ZHAO Chunhua

（School of

Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]Objective To compare the biological activity of adipose-derived mesenchymal stem cells （ADMSCs） between different extraction methods.

Methods ADMSCs were isolated using the direct digestion method and the Matrigel digestion method separately. The phenotype and proliferative activity of ADMSCs were determined. Real-time PCR was used to measure the mRNA expression of the adipogenic marker gene peroxisome proliferator-activated receptor γ （PPAR-γ） and the osteogenic marker gene runt-related transcription factor 2 （RUNX-2）. Western blot was used to determine the protein expression of PPAR-γ and RUNX-2.

Results Compared with those obtained by the direct digestion method， ADMSCs obtained by the Matrigel digestion method had significantly higher proliferative activity on day 3 of culture （F=727.139，P<0.05）， significantly increased PPAR-γ mRNA expression levels after 6-12 d of adipogenic induction （F=40.260-157.532，P<0.05）， a significantly increased PPAR-γ protein expression level after 6 d of adipogenic induction （F=1 501.475，P<0.05）， and significantly increased RUNX-2 mRNA levels after 3-12 d of osteogenic induction and RUNX-2 protein expression after 3 d of osteogenic induction （F=58.018-2 402.049，P<0.05）.

Conclusion ADMSCs obtained by the Matrigel digestion method show better potential of adipogenic and osteogenic differentiation than those obtained by the direct digestion method.

[KEY WORDS]mesenchymal stem cells; adipose tissue; adipose differentiation; osteogenic differentiation

干細(xì)胞憑借自身強(qiáng)分化和自我更新能力在細(xì)胞治療策略中有著較好的應(yīng)用前景，但干細(xì)胞治療面臨的問題是穩(wěn)定高效細(xì)胞來源相對(duì)匱乏[1]。脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（ADMSCs）因相較骨髓、臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有較易收集并且提取過程相對(duì)簡單的優(yōu)點(diǎn)，成為目前應(yīng)用較為廣泛的間充質(zhì)干細(xì)

胞[2-4]。ADMSCs的提取方法不同是否會(huì)影響其生

物學(xué)活性尚不清楚。本研究分別應(yīng)用直接消化法和干細(xì)胞基質(zhì)膠消化法分離提取ADMSCs，比較其增殖活力、成骨、成脂定向分化能力的差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

ADMSCs來自臨床吸脂術(shù)后廢棄的脂肪組織;實(shí)驗(yàn)所用的高糖DMEM、DME/F12培養(yǎng)基均來自美國Hyclone公司;鏈霉素、胰蛋白酶、青霉素、抗體稀釋液購于新賽美公司;油紅O和茜素紅S染料購于美國Sigma公司;膠原酶P購于美國Roche公司;A、B型脂肪轉(zhuǎn)換器購于江蘇凱帕公司;小鼠抗人CD105、CD73、CD45、CD14、CD34、CD90、HLA-DR直標(biāo)抗體均購于美國BD公司;過氧化物酶體激活受體γ（PPAR-γ）和runt轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX-2）抗體購于上海abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基質(zhì)膠消化法分離提取ADMSCs 參考YAO等[5]來自脂肪組織的胞外基質(zhì)膠制備方法，在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。將脂肪組織混液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，以1 500 r/min離心3 min后脂肪組織可見明顯分層;將低密度脂肪層應(yīng)用B型轉(zhuǎn)換頭反復(fù)推注破壞脂肪組織，離心（1 500 r/min，5 min）得到下層膠狀物即低密度基質(zhì)膠;高密度脂肪層則通過A型轉(zhuǎn)換頭推注制備高密度基質(zhì)膠。等體積加入0.5 g/L膠原酶P，37 ℃搖床定速搖晃消化30 min，PBS清洗重懸，將獲得的高密度基質(zhì)膠、低密度基質(zhì)膠底部細(xì)胞沉淀均接種于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，初始接種密度為2.0×106/cm2。應(yīng)用此種提取方法分別獲得高密度脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（G MSC）組和低密度脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（D MSC）組的ADMSCs。

1.2.2 直接消化法分離提取ADMSCs 將脂肪組織混液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中（用量同基質(zhì)膠消化法），使用適量PBS液清洗，700 r/min離心4 min后吸棄下層PBS液保留上層脂肪組織，等體積加入0.5 g/L膠原酶P，37 ℃搖床定速搖晃消化30 min，消化完成后應(yīng)用1.2.1方法接種細(xì)胞，獲得脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC組）。

取3組傳代至第5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定ADMSCs細(xì)胞免疫學(xué)表型

細(xì)胞以每孔1.2×106/cm2密度接種于6孔板內(nèi)，觀察其生長狀態(tài)，達(dá)到80%～90%融匯時(shí)收集至EP管中，PBS清洗、重懸，分別加入相應(yīng)直標(biāo)抗體，4 ℃孵育30 min，使用PBS清洗未結(jié)合的抗體，重復(fù)清洗1次后使用400 μL的PBS液重懸，在流式細(xì)胞儀上檢測各組ADMSCs的免疫學(xué)表型。

1.2.4 細(xì)胞增殖活力檢測 細(xì)胞以每孔8×104/cm2密度接種于96孔板，細(xì)胞正常貼壁生長后，應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖活力，按試劑盒說明進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀檢測各組的吸光度值，以其表示細(xì)胞的增殖活力。

1.2.5 ADMSCs體外成骨、成脂誘導(dǎo)及鑒定 細(xì)胞以每孔2.5×105/cm2密度接種于24孔板內(nèi)，隔天更換新配制的成骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，此后隔3 d更換新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基。鑒定：按照操作指南的方法配制堿性磷酸酶染色液、1 g/L濃度茜素紅S染色工作液及油紅O染色工作液，將誘導(dǎo)12 d后的各組ADMSCs使用PBS沖洗3次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，固定完成后洗3次，加入染色液，置于37 ℃恒溫箱中孵育30 min;取出后使用PBS洗3次，光鏡觀察3組細(xì)胞堿性磷酸酶藍(lán)色沉淀、細(xì)胞成骨分化后紅色鈣質(zhì)結(jié)節(jié)、細(xì)胞成脂分化后細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴的產(chǎn)生情況。

1.2.6 Real-time PCR檢測成脂相關(guān)基因PPAR-γ和成骨相關(guān)基因RUNX-2的mRNA表達(dá) 細(xì)胞以每孔1.2×106/cm2密度接種于6孔板內(nèi)，進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)分化。參照RNA總提取試劑說明書的方法分別提取成骨誘導(dǎo)3 d后和成脂誘導(dǎo)6 d后各組細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄。條件為：25 ℃，5 min;42 ℃，30 min;85 ℃，5 min。參照 SYBR Green Master Mix（No Rox）試劑盒操作手冊(cè)方法進(jìn)行Real-time PCR檢測。以GAPDH作為內(nèi)參照基因，通過循環(huán)擴(kuò)增的ct值分析PPAR-γ和RUNX-2的mRNA表達(dá)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.7 Western blot方法檢測成脂及成骨蛋白表達(dá)

細(xì)胞以每孔1.2×106/cm2密度接種于6孔板內(nèi)，成脂、成骨誘導(dǎo)分化后，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白樣品，按照SDS-PAGE凝膠試劑盒操作指南制膠，恒壓電泳將所提取的蛋白樣品分離，隨后恒流條件下轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜;使用100 g/L的脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后分別加入 GADPH、RUNX-2、PPAR-γ的一抗4 ℃孵育過夜，隔天洗膜后加入二抗室溫孵育1 h;使用ECL發(fā)光檢測試劑盒顯影。以GAPDH作為內(nèi)參照蛋白，Image J軟件分析蛋白電泳條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8、SPSS 26軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析;具有組別和時(shí)間兩種因素計(jì)量資料比較采用雙因素方差分析，兩組之間數(shù)據(jù)比較使用LSD法。P<0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組ADMSCs生長形態(tài)和免疫表型鑒定

各組ADMSCs在原代細(xì)胞時(shí)期均為貼壁生長的梭形集聚生長;細(xì)胞培養(yǎng)至第3代時(shí)各組形態(tài)均為梭型，呈旋渦、魚群狀生長。3組第5代ADMSCs免疫表型鑒定結(jié)果見圖1和表1，均符合國際細(xì)胞學(xué)會(huì)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的定義標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 各組ADMSCs增殖活力比較

ADMSCs增殖活力在培養(yǎng)時(shí)間和組別之間存在交互作用（F=194.529，P<0.05）?；|(zhì)膠消化法得到的G MSC組和D MSC組細(xì)胞相對(duì)于直接消化法得到的MSC組細(xì)胞在培養(yǎng)第3天的增殖活力更高（F=727.139，P<0.05）。 見表2。

2.3 各組ADMSCs成脂、成骨誘導(dǎo)后分化能力

2.3.1 各組ADMSCs成脂基因表達(dá)的水平以及油紅O染色 雙因素方差分析顯示，成脂標(biāo)志基因PPAR-γ的mRNA表達(dá)在誘導(dǎo)時(shí)間和組別之間具有交互作用（F=26.321，P<0.05）;多重比較顯示，誘導(dǎo)分化后0、3 d各組PPAR-γ mRNA表達(dá)無明顯差異，成脂誘導(dǎo)6～12 d的G MSC組和D MSC組PPAR-γ的mRNA表達(dá)高于MSC組，差異有顯著意義（F=40.260～157.532，P<0.05）。見表3。油紅O染色觀察顯示，誘導(dǎo)至12 d時(shí)G MSC組和D MSC組較MSC組有相對(duì)多的油紅O染液著色的小脂滴（圖2 A）。

2.3.2 各組ADMSCs成骨基因表達(dá)以及堿性磷酸酶和茜素紅S染色 雙因素方差分析顯示，成骨標(biāo)志基因RUNX-2的mRNA表達(dá)在誘導(dǎo)時(shí)間和組別之間具有交互作用（F=113.162，P<0.05）;多重比較顯示，成骨誘導(dǎo)3～12 d時(shí)G MSC組和D MSC組RUNX-2 mRNA表達(dá)均高于MSC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=58.018～763.253，P<0.05）。見表4。在誘導(dǎo)至12 d時(shí)堿性磷酸酶和茜素紅S染色顯示，基質(zhì)膠消化法得到的兩組細(xì)胞有更多的藍(lán)色堿性沉淀物以及紅色鈣質(zhì)結(jié)節(jié)（圖2B）。

2.3.3 各組ADMSCs的PPAR-γ、RUNX-2蛋白表達(dá)比較 單因素方差分析顯示，成脂誘導(dǎo)分化6 d后G MSC組和D MSC組PPAR-γ蛋白表達(dá)水平高于MSC組（F=1 501.475，P<0.05）。成骨誘導(dǎo)分化3 d后G MSC組和D MSC組RUNX-2蛋白表達(dá)

高于MSC組（F=2 402.049，P<0.05）。見表5。

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞在抗衰老、提高機(jī)體免疫力和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用是人們一直以來所關(guān)注的。脂肪移植術(shù)目前作為一種公認(rèn)的外科手術(shù)被應(yīng)用在整形美容領(lǐng)域以及外傷組織修復(fù)中，ADMSCs的加入使得脂肪移植效果提高。其機(jī)制為：ADMSCs具有高度分化的能力，可以分化為成熟的脂肪細(xì)胞促進(jìn)脂肪生成，也可因?yàn)樽陨淼呐苑置跈C(jī)制分泌細(xì)胞因子、趨化因子促使血管再生，促進(jìn)損傷部位的組織再生能力，提高脂肪移植物在體內(nèi)的正常存活率[6-7]。

本文研究結(jié)果顯示，用基質(zhì)膠消化法分離得到的ADMSCs成脂誘導(dǎo)分化后標(biāo)志基因PPAR-γ的mRNA和蛋白表達(dá)水平較直接消化法更高，提示該方法分離獲取的ADMSCs有更好的成脂分化的能力。ADMSCs應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的另一個(gè)重要原因是其具有成骨分化能力。有研究顯示，良好的生物材料可以構(gòu)建一個(gè)相對(duì)良好的骨再生微環(huán)境，同時(shí)有ADMSCs的加入會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)骨組織的形成[8-9];注射自體ADMSCs用于治療骨關(guān)節(jié)炎的安全性及有效性評(píng)估顯示，ADMSCs的應(yīng)用緩解了骨關(guān)節(jié)炎病灶區(qū)的疼痛，同時(shí)減少了再生骨組織的缺損[10]。本研究結(jié)果顯示，基質(zhì)膠消化法分離提取的ADMSCs有更高的RUNX-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，提示其擁有較好的成骨分化潛能。這些結(jié)果表明，ADMSCs應(yīng)用于整形美容、組織充填、骨生理以及骨再生領(lǐng)域是十分有競爭力的。ADMSCs的應(yīng)用已經(jīng)不僅局限于整形美容和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其具有的免疫調(diào)節(jié)能力、旁分泌能力也被證實(shí)對(duì)肝臟、呼吸循環(huán)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等都有著一定的緩解作用[11-12]。但其機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）