蘭潔 田維兵 徐龍芳 徐慧 劉世國(guó) 王芳

[摘要] 目的 探討山東地區(qū)先天性甲狀腺功能低下癥（CH）伴甲狀腺發(fā)育不良（TD）病兒HOXA5基因突變的特征及其基因型-表現(xiàn)型的關(guān)系。

方法 收集山東地區(qū)266例CH伴T(mén)D病兒血液標(biāo)本，從外周血白細(xì)胞中提取全基因組DNA，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增HOXA5基因的外顯子區(qū)及外顯子與內(nèi)含子交界處100 bp的區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物用Sanger測(cè)序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

結(jié)果 266例病兒中發(fā)現(xiàn)2例（0.75%）病兒分別攜帶HOXA5 c.34C>G（p.R12G）和c.337G>A（p.D113N）新的錯(cuò)義雜合突變，而在200例同種族的正常人中沒(méi)有檢測(cè)到這些突變位點(diǎn)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）指南分析發(fā)現(xiàn)，突變c.34C>G（p.R12G）和c.337G>A（p.D113N）都可能致病。

結(jié)論 在山東地區(qū)CH伴T(mén)D病兒中發(fā)現(xiàn)2個(gè)新的HOXA5基因突變，表明HOXA5基因突變與CH的發(fā)病有關(guān)，HOXA5基因可能是CH伴T(mén)D的候選致病基因，然而基因型與表現(xiàn)型之間的關(guān)系尚不明確。

[關(guān)鍵詞] 先天性甲狀腺功能減退癥;甲狀腺發(fā)育不全;基因，同源盒;突變;山東

[中圖分類(lèi)號(hào)] R581.21;R581.9

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2021）06-0796-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.146

[開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210706.1546.001.html;2021-07-07 09：00：45

DETECTION AND PATHOGENICITY ANALYSIS OF HOXA5 GENE MUTATION IN CHILDREN WITH CONGENITAL HYPOTHYROIDISM AND THYROID DYSGENESIS IN SHANDONG， CHINA

LAN Jie， TIAN Weibing， XU Longfang， XU Hui， LIU Shiguo， WANG Fang

（Department of Endocrinology and Metabolism， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the features of HOXA5 gene mutation and its genotype-phenotype relationship in children with congenital hypothyroidism （CH） and thyroid dysgenesis （TD） in Shandong， China.

Methods Blood samples were collected from 266 children with CH and TD in Shandong， and whole genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes. Polymerase chain reaction was used to amplify the exon region of the HOXA5 gene and the 100 bp region at the junction of the exon and the intron， and Sanger sequencing was performed for the amplified products. A bioinformatics analysis was also performed.

Results Among these 266 children， 2 （0.75%） were found to have novel missense heterozygotes mutations of the HOXA5 gene， i.e.， c.34C>G（p.R12G） and c.337G>A（p.D113N）， while these mutations were not detected in 200 normal individuals of the same ethnicity. Bioinformatics prediction and ACMG guideline analysis showed that both c.34C>G（p.R12G） and c.337G>A（p.D113N） mutations might be pathogenic.

Conclusion Two novel HOXA5 gene mutations are found in children with CH and TD in Shandong， suggesting that HOXA5 gene mutation is associated with the development of CH and the HOXA5 gene may be a candidate pathogenic gene for CH with TD. However， the genotype-phenotype relationship remains unclear and needs further study.

[KEY WORDS]congenital hypothyroidism; thyroid dysgenesis; genes， homeobox; mutation; Shandong

先天性甲狀腺功能低下癥（CH）是最常見(jiàn)的新生兒內(nèi)分泌疾病之一，由于胚胎期某些病因的作用使甲狀腺軸的發(fā)生、發(fā)育和功能出現(xiàn)異常，導(dǎo)致血循環(huán)中甲狀腺激素水平減低，引起病兒生長(zhǎng)發(fā)育遲滯、智力發(fā)育障礙和生理功能低下等，俗稱(chēng)呆小癥。全球范圍內(nèi)新生兒CH發(fā)病率為1/（1 400～2 800），男女之比為1∶2[1-2]。雖然遺傳因素被證明與不到10%的CH有關(guān)[3]，但在此基礎(chǔ)上，CH可分為甲狀腺發(fā)育不全（TD）和甲狀腺激素合成障礙兩類(lèi)，TD約占CH病人的85%，是甲狀腺形成過(guò)程異常導(dǎo)致的缺如、異位和發(fā)育不良等[4-5]，其中異位甲狀腺最常見(jiàn)，占TD病人的50%～60%，且通常位于舌下位置[5]。另外15%的CH是由甲狀腺激素合成及代謝障礙所引起，與雙氧化酶2（DUOX2）、甲狀腺球蛋白（TG）和甲狀腺過(guò)氧化物酶（TPO）等基因突變相關(guān)[6]。TD通常被認(rèn)為是一種散發(fā)性疾病，盡管2%的家族性病例支持孟德?tīng)栠z傳，但不能排除其他遺傳方式，如多基因、多因素和表觀遺傳[7-8]。TD單基因遺傳方式可能和參與甲狀腺形成的幾個(gè)基因的突變有關(guān)，包括TSHR、NKX2.1、FOXE1以及PAX8 [9-10]。 最近研究又發(fā)現(xiàn)幾個(gè)與TD相關(guān)的致病基因：NKX2-5、GLIS3、JAG1、CDCA8、TUBB1、NTN1等[11]。然而，這些所有已知致病基因的病例只占TD病人的5%，大多數(shù)TD病例的病因分子機(jī)制尚未明確，可能存在未發(fā)現(xiàn)的新基因突變。

2003年有國(guó)外學(xué)者首次在HOXA5-/-小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，幸存的突變小鼠出現(xiàn)甲狀腺功能減退癥表現(xiàn)，包括短暫性生長(zhǎng)遲緩、延遲眼開(kāi)放和耳朵抬高等[12]。HOXA5 屬于同源盒基因（HOX）家族，位于7p15.2，包含2個(gè)外顯子，編碼由270個(gè)氨基酸組成的ANTP類(lèi)同源結(jié)構(gòu)域蛋白[13]，該蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控基因的表達(dá)、細(xì)胞分化和機(jī)體形態(tài)的發(fā)生。HOXA5基因在呼吸道、消化道的形態(tài)發(fā)生，甲狀腺和乳房的發(fā)育，以及卵巢的動(dòng)態(tài)平衡中起重要作用[14]。MEUNIER等[12]證實(shí)，HOXA5基因可能作用于與甲狀腺功能和發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)基因Nkx2-1、Pax8和Titf2的表達(dá)而影響甲狀腺的發(fā)育。但是，至今未見(jiàn)關(guān)于該基因在CH病人中突變的報(bào)道，其致病機(jī)制仍不清楚。故本研究對(duì)山東地區(qū)266例確診為CH伴T(mén)D的病兒進(jìn)行了HOXA5基因變異篩查，旨在探討HOXA5基因突變與山東地區(qū)CH伴T(mén)D病兒的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2010 年6 月—2018 年10月，于山東省各地級(jí)市（濟(jì)南、青島、濟(jì)寧、臨沂、煙臺(tái)、棗莊、淄博、濰坊、聊城、泰安和德州）共選取266例CH伴T(mén)D病兒為研究對(duì)象，其中包括118例（44.4%）甲狀腺缺如，81例（30.5%）甲狀腺異位，67例（25.2%）甲狀腺發(fā)育不良。266例病兒中，男性120例，女性146例，男女之比為1∶1.2;平均年齡為（3.5±1.8）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①出生后72 h～7 d的新生兒，用濾紙從足跟采血，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定促甲狀腺激素（TSH）水平，TSH≥20 mU/L者召回復(fù)查，電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定游離甲狀腺素（FT4）水平低（正常范圍為12～22 pmol/L）、血清TSH水平高（正常范圍為0.27～4.20 mU/L）者，診斷為CH;②病兒經(jīng)甲狀腺B 超或甲狀腺核素掃描確診為T(mén)D;③所有病兒無(wú)血緣關(guān)系且經(jīng)過(guò)體檢已排除CH外的其他先天性疾病。選取新生兒篩查中甲狀腺功能正常的200例新生兒作為對(duì)照組。本研究獲得了青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018-036），且已告知病兒及對(duì)照新生兒家屬并獲取知情同意。

1.2 基因提取

使用血凝塊DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作，從266例病兒和200例對(duì)照新生兒的血液樣本中提取DNA，用紫外線分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度與純度，需在OD260處有顯著吸收峰，OD260/OD280比值應(yīng)為1.7～1.9?；蛱崛『笾?20 ℃保存。

1.3 PCR擴(kuò)增

①引物設(shè)計(jì)：使用DNASTAR 7.1軟件設(shè)計(jì)HOXA5基因全編碼區(qū)（外顯子區(qū)及外顯子與內(nèi)含子交界處100 bp的區(qū)域）引物，由美國(guó)賽默飛世爾公司合成。引物序列和擴(kuò)增長(zhǎng)度見(jiàn)表1。②反應(yīng)體系為：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，雙蒸水7 μL，2×Master Mix（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）10 μL，DNA模板2 μL（50～100 μg/L），共20 μL。③反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃再延伸5～10 min，4 ℃保存。

1.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序

將5 μL PCR產(chǎn)物原液和1 μL 6×DNA上樣緩沖液加入到10 g/L瓊脂糖凝膠孔中，在1×TAE電泳液中，130 V電泳25 min，采用Bio-Rad GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。如果目的條帶單一且清晰明亮，則使用ABI 3730XL自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化及Sanger測(cè)序。

1.5 測(cè)序結(jié)果的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用BioEdit V7.0.1分析測(cè)序結(jié)果并與NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中HOXA5基因序列（NM_019102.4）進(jìn)行比對(duì)，從中找出可能存在的基因突變位點(diǎn)。對(duì)檢測(cè)到的突變體進(jìn)行蛋白保守性分析，比較多個(gè)物種之間的同源性，最后通過(guò) PROVEAN、SIFT（http：//provean.jcvi.org/index.php）， Polyphen-2 （http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）， MutationTaster（http：//www.mutationtaster.org/）預(yù)測(cè)所發(fā)現(xiàn)突變的有害性，并依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）的評(píng)估指南[15]，對(duì)基因突變進(jìn)行致病性分析。

2 結(jié)果

2.1 HOXA5 基因檢測(cè)

在266例CH伴T(mén)D病兒中分別檢測(cè)到1例HOXA5基因c.34C>G（p.R12G）突變（圖1A）和1例HOXA5基因c.337G>A（p.D113N）突變（圖1B），均為錯(cuò)義雜合突變。2例病兒攜帶的突變均位于HOXA5基因第1號(hào)外顯子，其中c.34C>G的第34位堿基由C變?yōu)镚，導(dǎo)致第12位密碼子的精氨酸變?yōu)楦拾彼幔╬.R12G），c.337G>A的第337位堿基由G變成A，使得第113位密碼子的天冬氨酸變成天冬酰胺（p.D113N）。在200例正常對(duì)照新生兒中均未檢測(cè)到這兩個(gè)變異（圖1）。

2.2 突變生物信息學(xué)分析

用DNAMAN軟件對(duì)不同物種的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)顯示，p.R12G、p.D113N兩個(gè)突變均位于HOXA5基因保守區(qū)域（圖2）。用多種生物信息學(xué)軟件（PROVEAN、SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster）預(yù)測(cè)突變的蛋白危害性，依據(jù)ACMG遺傳變異分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)和指南，本研究中檢測(cè)到的HOXA5基因的兩個(gè)突變c.34C>G/p.R12G （PS4、PM2、PM6、PP3）和c.337G>A/p.D113N（PS4、PM2、PM6）都被判定為“可能致病”。見(jiàn)表2。

2.3 基因型與表現(xiàn)型的關(guān)系

病兒1（HOXA5基因c.34C>G/p.R12G）為男性病兒，妊娠39周時(shí)經(jīng)剖宮產(chǎn)分娩，出生體質(zhì)量3 400 g，出生身高49 cm，Apgar評(píng)分10分。新生兒篩查示足跟血TSH 112.5 mU/L，出生后14 d被召回復(fù)查甲狀腺功能，結(jié)果示TSH 168.1 mU/L、FT4 5.8 pmol/L、FT3 4.5 pmol/L，診斷為CH。該病兒父母甲狀腺B超檢查均正常，無(wú)CH家族史。治療前行甲狀腺99mTc掃描示甲狀腺缺如。病兒表現(xiàn)為輕微的嗜睡和較嚴(yán)重的黃疸，服用左旋甲狀腺素（優(yōu)甲樂(lè)）治療至今，初始劑量為25 μg/d，5年后現(xiàn)用藥劑量為75 μg/d。病兒2（HOXA5 c.337G>A/p.D113N） 為女性病兒，母親有孕期一過(guò)性甲狀腺功能異常史，妊娠40周時(shí)經(jīng)陰道分娩，出生體質(zhì)量3 650 g，出生身高48 cm，Apgar評(píng)分10分。新生兒篩查示足跟血TSH 66.7 mU/L，出生12 d時(shí)被召回復(fù)查甲狀腺功能，結(jié)果示TSH 135 mU/L，F(xiàn)T4 4.2 pmol/L，F(xiàn)T3 3.8 pmol/L。甲狀腺99mTc掃描示甲狀腺發(fā)育不良，甲狀腺未分葉，呈球形，大小約為3.1 cm×2.0 cm。初始服用優(yōu)甲樂(lè)劑量為25 μg/d，7年后現(xiàn)用藥劑量為50 μg/d?，F(xiàn)2例病兒生長(zhǎng)發(fā)育和智力都正常。

3 討論

甲狀腺的形態(tài)發(fā)育起源于原始咽部?jī)?nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)嵴細(xì)胞這兩種不同的前體，前者形成甲狀腺濾泡細(xì)胞（TFC），后者在發(fā)育早期遷移至雙側(cè)多鰓肌體，生成濾泡旁C細(xì)胞[11]。TFC是腺體中數(shù)量占95%的細(xì)胞群，形成甲狀腺濾泡，其球形結(jié)構(gòu)用于儲(chǔ)存和控制甲狀腺激素的釋放[16-17]。在原始咽部的內(nèi)皮細(xì)胞中，甲狀腺原基的發(fā)育分別發(fā)生在小鼠和人胚胎發(fā)育的8.0～8.5 d和20.0～22.0 d，分別在13.5 d和45.0～50.0 d完成向下遷移[18]。從小鼠胚胎發(fā)育8.5 d開(kāi)始，TFC已經(jīng)獲得明顯的分子特征，即共表達(dá)4種轉(zhuǎn)錄因子（HHEX、Nkx2.1、Pax8和Foxe1）[19]，這表明它們是甲狀腺早期階段形態(tài)發(fā)生所必需的。甲狀腺形態(tài)發(fā)生異常或甲狀腺發(fā)育不全通常是由于調(diào)節(jié)甲狀腺發(fā)育的基因發(fā)生突變，然而僅有小部分是由NKX2.1、FOXE1、PAX8、HHEX和TSHR等這些已知的基因缺陷造成的，大多數(shù)TD病例的病因分子機(jī)制目前尚不清楚。本文納入266例確診CH伴T(mén)D病兒，對(duì)可能和甲狀腺發(fā)育相關(guān)的基因HOXA5進(jìn)行全編碼區(qū)PCR擴(kuò)增及Sanger測(cè)序篩查突變，發(fā)現(xiàn)了2例（0.75%）病兒均攜帶一個(gè)可能致病的突變基因。

HOX是一個(gè)高度保守的基因家族，在控制體節(jié)特異性結(jié)構(gòu)的形成中占據(jù)中心地位[20]。因此，HOX基因的突變會(huì)改變節(jié)段的同一性并導(dǎo)致形態(tài)缺陷[21]。在哺乳動(dòng)物中，HOX家族包含4個(gè)HOX簇（A、B、C和D）中的39個(gè)基因，這39個(gè)基因又可進(jìn)一步細(xì)分為13個(gè)平行對(duì)數(shù)組（PG1～PG13）[22]，HOXA5是A簇、PG5的一個(gè)成員。人類(lèi)HOXA5基因編碼分子量29 000大小、包含270個(gè)氨基酸的蛋白，該蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[23]。目前對(duì)于HOXA5的研究主要集中于其在多種癌癥中的異常表達(dá)，研究表明其可能與癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡過(guò)程有關(guān)[24]，而其與甲狀腺疾病關(guān)系的相關(guān)研究較少。MEUNIER等[12]對(duì)hoxa5-/-突變小鼠的表型調(diào)查結(jié)果表明，幸存的突變小鼠表現(xiàn)出一過(guò)性生長(zhǎng)遲緩、睜眼和耳朵抬起延遲等甲狀腺功能減退的癥狀;hoxa5-/-小鼠與野生型雜合子小鼠相比較，T4水平差異無(wú)顯著性，但在15日齡時(shí)，hoxa5-/-小鼠TSH水平比野生型高43%，2 d后二者水平一致;此外，進(jìn)一步的研究表明，HOXA5基因功能喪失導(dǎo)致甲狀腺功能和發(fā)育的基本調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平發(fā)生了短暫的變化[12]。這與HOXA5基因敲除后在呼吸道形態(tài)發(fā)生過(guò)程中觀察到的結(jié)果有相似之處，即突變體中多個(gè)基因表達(dá)水平的微小變化可能是由于HOXA5功能缺乏而導(dǎo)致的整體變化[25]。然而，在CH的人群中，到目前為止未有HOXA5基因突變的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)2例病兒分別攜帶HOXA5 c.34C>G/p.R12G和c.337G>A/p.D113N雜合突變，且這兩個(gè)變異為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。其中突變c.34C>G/p.R12G使HOXA5第12位的精氨酸變?yōu)楦拾彼?，而c.337G>A/p.D113N導(dǎo)致第113位的天冬氨酸變?yōu)樘於０?。進(jìn)一步生物信息學(xué)分析表明，兩個(gè)突變都位于HOXA5蛋白相對(duì)保守區(qū)，而且多種致病性預(yù)測(cè)軟件和ACMG評(píng)級(jí)的結(jié)果均顯示，c.34C>G/p.R12G、c.337G>A/p.D113N均為“可能致病”變異。本研究首次發(fā)現(xiàn)HOXA5基因突變與人類(lèi)CH的發(fā)病有關(guān)，并且認(rèn)為HOXA5可能是CH伴T(mén)D的候選致病基因。此外，本研究發(fā)現(xiàn)2例攜帶HOXA5基因突變的病兒均有明顯的甲狀腺結(jié)構(gòu)和功能異常，在新生兒篩查時(shí)期也均檢測(cè)到高水平的TSH。甲狀腺超聲檢查示1例病兒甲狀腺缺如，另1例病兒甲狀腺發(fā)育不良。然而，基因型和表現(xiàn)型的關(guān)系還可能受其他多種因素的影響，仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行研究。

上述HOXA5基因突變引起CH的機(jī)制尚不清楚，HOXA5的表達(dá)僅限于毗鄰甲狀腺的間質(zhì)，提示該基因?qū)谞钕侔l(fā)育和功能的作用必須由信號(hào)分子介導(dǎo)[12]。HOXA5在肺、胃和腸形態(tài)發(fā)生過(guò)程中控制間充質(zhì)-上皮串?dāng)_的報(bào)道[26]進(jìn)一步支持了這一假說(shuō)。關(guān)于這種非細(xì)胞自主方式如何影響甲狀腺的形成還有待進(jìn)一步研究。此外，由于本研究中山東地區(qū)HOXA5基因變異率較低，僅為0.75%，我們正在全國(guó)范圍內(nèi)擴(kuò)大樣本量，將通過(guò)新一代高通量測(cè)序進(jìn)一步篩選HOXA5基因變異，并通過(guò)后續(xù)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HOXA5基因變異的致病性。

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（本文編輯 馬偉平）