李霞 林芳 雷代坤 高曉唯 劉毅 李鵬 蔡巖

隨著飛秒激光近視手術的發(fā)展，飛秒激光微小切口角膜基質透鏡取出術(small incision lenticule extraction,SMILE)中，透明角膜基質取材廣泛，如能對其加以利用，將對臨床有重要的指導意義。角膜損傷伴有角膜組織缺損，如直接縫合，常發(fā)生角膜變形，房水滲漏，形成淺前房、眼內感染等并發(fā)癥。為了避免這些并發(fā)癥的發(fā)生，臨床上通常強行縫合角膜穿孔傷，但術后較嚴重的高度散光和不規(guī)則瘢痕愈合，極度影響II期、III期的術后效果。 本研究制作兔透明角膜基質透鏡修復角膜缺損動物模型，觀察其在角膜組織損傷修復中的機制及作用。

資料與方法

一、實驗材料

1.健康清潔級新西蘭白兔30只，雌雄兼用，質量2.00～2.50 kg，年齡2～3個月，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。

2.透明角膜基質的取材：人角膜基質透鏡組織

圖1 角膜缺損模型設計及制作方法 先行前房穿刺(黑色箭頭)，用消毒濾紙片貼服于角膜中央(圖A)，剖切角膜缺損模型(圖 B) 圖2 2 mm× 3 mm ×3 mm術后 圖A、B 術后1 d，角膜植片混濁，皺褶，部分虹膜前粘連，前房殘留少量氣泡，前房形成欠佳，故再次行前房注氣，形成前房；術后3個月，上方周邊仍有少量虹膜前粘連，雖然前房形成，但新生血管侵入角膜(黑色箭頭)，角膜白斑愈合(圖C、D) 圖3 2 mm×2 mm×2 mm 術后 圖A 術后1 d，角膜植片混濁，角膜縫線固定，前房形成，前房內殘留氣泡，虹膜紋理清晰，瞳孔藥物性散大，前房未見有炎癥反應。術后1個月，角膜瘢翳形成，角膜縫線固定(圖B)，隨著時間推移，2個月時部分縫線松弛(圖C)，術后3個月時角膜瘢痕愈合，已拆除松弛的角膜縫線(圖D) 圖4 2 mm× 2 mm ×2 mm術后3個月 圖A、B 其他模型術后3個月，角膜單層圈套縫合，角膜瘢翳、云翳愈合，縫線上有分泌物粘附，角膜曲率基本正常來源于在我院近視眼治療中心行 SMILE 的近視健康患者( 2019年6月)。

表1 透明角膜基質修復角膜缺損的長期效果

圖5 眼前節(jié)OCT、Pentacam、角膜地形圖檢查(術后3個月) 前節(jié)OCT顯示：A組角膜缺損處，角膜基質填塞，角膜凹凸不平，角膜內皮面有虹膜粘附(圖A)，B組角膜缺損處，角膜基質填塞，角膜曲率平緩，但層間有間隙(圖B)， Pentacam檢查顯示缺損處角膜高度突出，整體角膜曲率基本正常(圖C)，角膜地形圖顯示，角膜散光仍較大(圖D)

3.透明角膜基質保存(30只眼)：藥用無水甘油保存[1]。使用時，取出透明角膜基質置于4 ℃的平衡鹽中，去除黏附的甘油，備用。

二、實驗方法

透明角膜基質修復角膜缺損模型制作：新西蘭白兔30只(30只眼)，肌肉注射速眠新(1 ml/kg)，配合水合氯醛溶液(3 ml/kg)經耳緣靜脈注射全身麻醉，并用鹽酸丙美卡因滴眼液(5 ml/l)滴眼3次表面麻醉，術前聚氨碘氟酮消毒，手術均在顯微鏡下實施，用含慶大霉素的生理鹽水沖洗結膜囊，上直肌固定縫線，A組用2 mm×3 mm×3 mm、B組用2 mm×2 mm×2 mm大小的消毒濾紙片貼服于右眼角膜中央(見圖1)，選在透明角膜緣做前房穿刺，用尖刀剖切制作全層角膜缺損模型，取復水的透明角膜基質填塞于角膜缺損處，A組用單層、B組用雙層圈套縫合聯(lián)合斜形交叉、加固縫合，術畢散瞳，涂氧氟沙星眼膏。

三、術后處理

常規(guī)給予左氧氟沙星滴眼液點3/d、復方托比卡胺滴眼液點眼3/d、氧氟沙星眼膏點眼1/晚。造模后每日所有動物行裂隙燈觀察眼前節(jié)變化，于造模后1 d、1周、1個月、3個月后各時間點行眼前節(jié)照相。3個月行Pentacam、角膜地形圖檢查后全部處死，光鏡檢查。

結 果

一、角膜缺損修復情況(見圖2～5)

二、長期效果：見表(1)，術后3個月，A組：角膜瘢翳1只眼(6.7%)、角膜白斑14只眼(93.3%)、虹膜部分前粘連10只眼(66.7%)，新生血管侵入角膜11只眼(73.3%)，B組：角膜瘢翳6 只眼40.0%)、角膜白斑9只眼(60.0%)、新生血管侵入角膜1只眼(60.0%)，無虹膜前粘連。

所有透明角膜基質修復角膜缺損的動物均無排斥反應發(fā)生。B組術后隨訪3個月均保持正常的眼球外觀，無淺前房、前房出血、排斥反應、角膜裂傷陊開、嚴重角膜扭曲變形發(fā)生。

三、組織病理學檢查(見圖6)

討 論

對于角膜缺損修復，縫合技巧雖然至關重要，但修復材料決定了修復的效果。角膜組織缺損的臨床最佳治療方式可行穿透性角膜移植術，但新鮮角膜來源有限且手術難度較大，開展較為困難。筋膜、羊膜、鞏膜組織、自體角膜、異體角膜等角膜替代物各有其優(yōu)缺點[2-6]，因此在臨床工作中，開發(fā)和利用角膜替代物具有重要意義。

圖6 角膜組織切片HE染色 角膜基質層可見大量的中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞浸潤，角膜上皮局部粘附略松弛，基質層可見新生血管管腔(x 100，A組，圖A，黑色箭頭)，有大量漿細胞及少量成纖維細胞(x 100, B組，圖B)

近年來，有報道利用SMILE手術摘除的角膜基質透鏡治療角膜穿孔，基質透鏡作為角膜基質的替代組織用于自體移植或異體供體移植已被報道[7-10]。有角膜基質透鏡治療遠視、老花眼，聯(lián)合用角膜交聯(lián)治療角膜基質擴張、圓錐角膜等的研究[11-15]。亦有基質小透鏡作為補片移植物在治療其他眼病中的應用[16，17]。角膜基質透鏡有以下幾個方面的優(yōu)點，首先，角膜基質透鏡具有良好的生物相容性和強度，薄而透明，其次該透鏡很容易通過SMILE手術提取，并且成本低廉；但是基質透鏡仍有幾個缺點，在不做SMILE手術的醫(yī)院很難獲得，此外，單個角膜基質透鏡的強度及力度仍較弱，直接縫合時容易撕裂，臨床應用有其局限性且需進一步研究觀察。目前除了上述臨床報道外，在動物實驗中尚未被探索。

SMILE來源的人角膜基質透鏡移植可以有效的治療感染或外傷導致的角膜穿孔。但是，角膜基質透鏡究竟可以治療多大的角膜缺損呢？因此我們制作兔透明角膜基質透鏡修復角膜缺損動物模型，嘗試探索其在角膜組織損傷修復中的適應癥、機制及其作用。

我們的研究發(fā)現(xiàn)對于3 mm及以上的全層缺損，縫合困難，A組因虹膜部分前粘連模型較多，前房形成率欠佳，角膜漏導致虹膜前粘連(高達66.7%))，故角膜新生血管發(fā)生率較高(73.3%)，且角膜基質透鏡厚度有限，雖然多層疊加、單層折疊后，或許可以達到有效的厚度，但手術操作難度大，縫合時透鏡片滑動或撕裂，導致植片變形及邊緣成角，造成角膜漏、散光或虹膜前粘連(圖5A)、植片混濁、角膜新生血管侵入(圖2D)。但對于2 mm的角膜全層缺損B組，術后觀察期間內，術眼未出現(xiàn)感染，出血等并發(fā)癥；未見植片脫落、植片融解、角膜鈣化和免疫排斥等現(xiàn)象，出現(xiàn)1例(6.7%)植片和植床新生血管，所有模型以角膜瘢翳(40.0%) 、角膜白斑(60.0%)愈合(見圖3D、圖4A、圖4B)。但前節(jié)OCT顯示仍有層間間隙形成(圖5B)，所以，對于單純折疊來縫合臨床上仍存在一些問題，應行角膜層間粘合后再進行角膜裂傷縫合較為穩(wěn)妥[9，10]；B組3個月時雖然縫合處仍有凸起，但角膜曲率基本平滑(圖5C)，角膜地形圖顯示縫合區(qū)域仍有散光(如圖5D)，因此，單純疊加的角膜基質透鏡的生物力學強度還有待進一步加強。

我們實驗局限性是，沒有設計板層缺損，并且它不包括使用與羊膜聯(lián)合應用情況，我們臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，角膜基質透鏡與羊膜一起使用時，成功率及術后視力恢復較單純角膜基質透鏡好。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，對于大于2 mm×3 mm×3 mm的缺損，行縫合較為困難，最好行全穿透性角膜移植術或至少聯(lián)合羊膜、筋膜移植；對于2 mm×2 mm×2 mm的角膜缺損，填塞的角膜基質透鏡逐漸透明，與角膜組織融合緊密，角膜曲率相對平整，能夠成功保住眼球，患者的視力尚能部分恢復，可應用于角膜組織缺損的替代物，并為二期手術治療奠定基礎。