楊 煒 圻

（河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院，甘肅 張掖 734000）

表觀遺傳學(xué)是研究基因序列不發(fā)生改變的情況下，通過(guò)DNA甲基化、組蛋白修飾和空間結(jié)構(gòu)域的改變調(diào)節(jié)控制基因表達(dá)的的一門遺傳學(xué)的分支學(xué)科.在哺乳動(dòng)物基因組中，大約70%的胞嘧啶殘基在5’-CpG-3’都被甲基化，DNA甲基化操控著許多生物進(jìn)程，現(xiàn)已證明DNA甲基化與許多疾病有關(guān)，包括腫瘤、印記疾?。?］.

DNA 甲基化是在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環(huán)的五號(hào)碳原子上加上甲基的共價(jià)修飾過(guò)程.TET 蛋白家族能轉(zhuǎn)化5-甲基胞嘧啶為5-羥甲基胞嘧啶，從而啟動(dòng)去甲基化的過(guò)程［2］.DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則可誘導(dǎo)基因的重新活化和表達(dá).盡管DNA 甲基化在許多生物進(jìn)程中起重要作用，但由于缺乏廣泛可行的技術(shù)在特定的靶點(diǎn)添加或移除甲基化，其在許多疾病中的致病影響并不清楚. 在原理上，基因編輯技術(shù)可以應(yīng)用在靶向表觀遺傳學(xué)治療，但沒(méi)有特異性的方法能移除甲基化.像5-aza-2’脫氧胞苷能抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，常被用來(lái)研究甲基化的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)［3］.然而5-aza-2’脫氧胞苷是作用于整個(gè)基因組的去甲基化，很難針對(duì)特定的DNA甲基化區(qū)域進(jìn)行去甲基化，如果使用其進(jìn)行治療性的應(yīng)用會(huì)面對(duì)很多無(wú)法預(yù)料的問(wèn)題.

近年來(lái)，CRISPR/Cas9［4-6］這種基因編輯技術(shù)可以通過(guò)融合非催化活性核酸內(nèi)切酶來(lái)補(bǔ)充特異位點(diǎn)的催化活性. CRISPR/ dCas9 系統(tǒng)應(yīng)用dCas9能與DNA序列結(jié)合的能力，使其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，融合TET 結(jié)構(gòu)蛋白家族在細(xì)胞中能羥化特定的位點(diǎn)，可以激活去甲基化.這樣看來(lái)，CRIS?PR/ dCas9 技術(shù)的出現(xiàn)為DNA 靶向去甲基化提供了條件.

1 CRISPR/dCas9系統(tǒng)的作用機(jī)制

CRISPR/Cas9 是對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA 修飾的重要工具，其具有效率高、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn). CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以特異性的識(shí)別出外源DNA，并將它們切斷，沉默外源基因的表達(dá).CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是細(xì)菌針對(duì)噬菌體和質(zhì)粒DNA入侵進(jìn)化形成的一種獲得性免疫系統(tǒng).大約40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌擁有CRISPR/Cas 位點(diǎn)［7-9］.CRISPR/Cas 系統(tǒng)按照其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以分為3 大類型（I 型、II 型和III 型系統(tǒng)），它們的共同特點(diǎn)是RNA介導(dǎo)的核酸酶能夠特異性地切割外源入侵的DNA，包括噬菌體和質(zhì)粒DNA［5］.II型CRISPR/Cas系統(tǒng)鑒于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，目前被廣泛應(yīng)用于真核細(xì)胞的基因組編輯中.CRISPR位點(diǎn)由一系列短的重復(fù)序列（Repeats）構(gòu)成，這些重復(fù)序列被具有相同長(zhǎng)度的“間隔序列”隔開(kāi).間隔序列可與噬菌體基因組配對(duì)結(jié)合并使入侵細(xì)菌和古細(xì)菌的外源遺傳物質(zhì)降解. 當(dāng)外源噬菌體或質(zhì)粒入侵宿主菌時(shí)，“重復(fù)—間隔”陣列被轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)的crRNA 前體.crRNA 前體可被CRISPR-associate（Cas）核酸酶或者細(xì)菌內(nèi)源RNA 酶III 在重復(fù)序列處切割，并釋放出小的crRNA. 然后crRNA 與輔助小片段RNA（Trans-activatingcrRNA，tracrRNA）通過(guò)部分序列互補(bǔ)形成RNA 二聚體，該二聚體能夠被Cas9 蛋白特異識(shí)別并形成RNA蛋白復(fù)合體，通過(guò)crRNA序列中的間隔序列介導(dǎo)Cas9核酸酶發(fā)現(xiàn)靶序列并降解侵入物的基因組. 在自然狀態(tài)下，Cas9 由tracrRNA 和crRNA 前體介導(dǎo)至其靶點(diǎn)，在人工合成的系統(tǒng)中這2個(gè)短的RNA 可以被融合成一個(gè)嵌合的導(dǎo)向RNA（guideRNA）［10，11］.CRISPR/Cas9系統(tǒng)由單鏈的guideRNA 和有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白構(gòu)成，能特異性識(shí)別靶基因序列，并在靶定位點(diǎn)剪切雙鏈DNA，細(xì)胞的非同源末端連接修復(fù)機(jī)制重新連接斷裂處的基因組，并引入插入或缺失突變，也可提供一個(gè)外源雙鏈供體DNA片段通過(guò)同源重組整合進(jìn)斷裂處的基因組，從而達(dá)到對(duì)DNA修飾的目的［5，6］.CRISPR/Cas9系統(tǒng)能在293T、K562、iPS等多種細(xì)胞中，進(jìn)行有效的靶向酶切，非同源重組、同源重組效率在3%～25%之間，并能在多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行靶向酶切.

Cas9 的核酸酶剪切活性取決于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：RuvC和HNH.這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別負(fù)責(zé)切割DNA的兩條鏈，并且這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠單獨(dú)地被人工點(diǎn)突變失活.化膿性鏈球菌中存在一種Cas9D10A突變體，這種鏈球菌Cas9 的RuvC 失活（RuvC-），HNH 仍有活性（HNH+）；另一種Cas9H840A 的突變體的Cas9 蛋白則呈現(xiàn)RuvC 激活（RuvC+）和HNH 失活（HNH-）的狀態(tài)，但這兩種突變體的Cas9仍然具有核酸酶活性，可對(duì)靶向序列進(jìn)行剪切作用. 當(dāng)RuvC 和HNH 同時(shí)處于失活狀態(tài)時(shí)（D10A&H840A；RuvC-&HNH-），Cas9 將不具有核酸酶活性，成為dCas9（deadCas9）［12，13］.dCas9與靶向特定基因gRNA在細(xì)胞中共表達(dá)，則gRNA可以介導(dǎo)dCas9蛋白與DNA結(jié)合.如果dCas9結(jié)合到靶基因的閱讀框內(nèi)，可以阻斷RNA聚合酶的延伸作用，如果dCas9 結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，則可以阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始.研究者利用dCas9與DNA 序列結(jié)合的能力，將dCas9 與其他蛋白的融合，使其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，促進(jìn)或抑制基因的表達(dá).

2 CRISPR/dCas9系統(tǒng)靶向去甲基化的研究

DNA去甲基化催化酶在表觀遺傳調(diào)控中很重要，但尚不清楚這些胞嘧啶修飾如何被逆轉(zhuǎn).TET1 是一種α-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶，催化5-甲基胞嘧啶（5mC）轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC），還可以從5mC以酶促活性依賴性的方式生成5-甲?；奏ぃ?fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）［14］.He 等［15］研究表明，TET1 雙加氧酶將DNA 中的5mC 和5hmC 氧化為5caC 后，被修飾的5caC 被胸腺嘧啶-DNA 糖基化酶（TDG）特異性識(shí)別和切除，再通過(guò)堿基切除修復(fù)途徑使該位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為胞嘧啶，構(gòu)成了活性DNA去甲基化的途徑.

來(lái)自中科院上海生化細(xì)胞所的胡榮貴研究員課題組的研究員Xu等［16］用dCas9和gRNAs插入雙拷貝的噬菌體MS2RNA 元件，構(gòu)建了修改的單導(dǎo)向RNAs（sgRNAs）（sgRNA2.0），從而有利于TET1催化結(jié)構(gòu)域（TET1-CD）與dCas9 或MS2 外殼蛋白融合，進(jìn)而結(jié)合到特定基因位點(diǎn)行駛DNA去甲基化功能. 這個(gè)系統(tǒng)能顯著上調(diào)的轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因，并且dCas9/sgRNA2.0-directed 去甲基化能高效針對(duì)目標(biāo)基因，其脫靶率低.

日本科學(xué)家SumiyoMorita 等［17］更完整的應(yīng)用dCas9融合TET1進(jìn)行靶向去甲基化.失去剪切活性的dCas9融合具有催化活性的TET1（TET1CD），羥化特異性的位點(diǎn)以激活該位點(diǎn)的去甲基化.另外，加入SunTag補(bǔ)充TET1-CD，可以使TET1-CD的活性明顯改善［17］. SunTag 實(shí)質(zhì)上是一套分子掛鉤，其能夠?qū)⒍鄠€(gè)拷貝的生物活性分子掛到可用來(lái)靶向一些基因或其他的分子的蛋白質(zhì)支架上.相比于沒(méi)有這些掛鉤的組裝分子，整合了SunTag的分子生物活性顯著放大［18，19］.多重復(fù)拷貝的TET1 羥化酶和dCas9的融合極大地增強(qiáng)去甲基化的活性.SumiyoMorita 等還證明，dCas9 融合TET1 的系統(tǒng)適用于在胚胎干細(xì)胞，癌細(xì)胞系，原代神經(jīng)前體細(xì)胞和小鼠胎兒體內(nèi)的操縱特定位點(diǎn)的甲基化，使體內(nèi)治療表觀疾病成為可能.

Liu等［20］早期研究表明，dCas9和TET1或DN?MT3a融合可以精確編輯CpG甲基化區(qū)域，可以使甲基化或去甲基化啟動(dòng)子序列激活或者沉默，無(wú)論在體外還是體內(nèi).腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Ⅳ（BDNFⅣ）或肌分化轉(zhuǎn)錄激活因子MyoD的靶向去甲基化作用可以通過(guò)融合dCas9-TET1 加強(qiáng)，從而誘導(dǎo)BDNF在有絲分裂后的神經(jīng)元中表達(dá)或激活MyoD促進(jìn)成纖維細(xì)胞重編程為成肌細(xì)胞.新創(chuàng)靶向重新甲基化的CTCF環(huán)的位點(diǎn)，通過(guò)dCas9-DNMT3a融合蛋白阻斷基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子CTCF 綁定和干擾DNA 循環(huán)，導(dǎo)致鄰近基因環(huán)的表達(dá)改變.他們?cè)僖淮巫C實(shí)了dCas9 可以在體內(nèi)應(yīng)用于DNA 甲基化.

3 CRISPR/dCas9系統(tǒng)靶向去甲基化的應(yīng)用

CRISPR/dCas9系統(tǒng)靶向去甲基化中的研究結(jié)果表明，TET1、DNMT3a 和dCas9 融合，代表了一個(gè)強(qiáng)大的能夠編輯特定基因序列的DNA甲基化工具箱.Vojta等［21］研究表明，dCas9融合DNMT3a可用于兩個(gè)人類基因啟動(dòng)子，Xu 等［16］和Choud?hury 等［22］人研究表明，dCas9 融合TET1 可用于基因啟動(dòng)子去甲基化.應(yīng)用CRISPR/dCas9 系統(tǒng)可以使甲基化的編輯比以往更精準(zhǔn)高效.

Liu 等［23］利用其研究的DNA 甲基化編輯工具來(lái)逆轉(zhuǎn)超甲基化事件，證明了可以通過(guò)CRISPR介導(dǎo)的FMR1 基因的DNA 甲基化編輯來(lái)治療脆性X 綜合征（FXS）.脆性X 綜合征（FXS）是男性最常見(jiàn)的智力殘疾遺傳形式，是由于FXS患者FMR1基因的沉默與FMR1的5’UTR中CGG擴(kuò)展突變的超甲基化有關(guān)［24］. 該研究設(shè)計(jì)了一個(gè)單一的sgRNA，以指導(dǎo)dCas9-TET1有效地使病理FMR1基因座中的CGG 重復(fù)序列脫甲基.CGG 擴(kuò)展完全的去甲基化會(huì)導(dǎo)致CpG 島的甲基化不足，在FMR1 啟動(dòng)子處增加H3K27 乙酰化和H3K4 三甲基化，減少H3K9三甲基化，并解鎖FMR1基因的表觀遺傳沉默，從而恢復(fù)FXSiPSC和神經(jīng)元中的FMRP表達(dá)，且無(wú)明顯關(guān)閉定位效果.FMR1的表達(dá)噬菌體蛋白AcrIIA4 抑制dCas9-TET1 后，在編輯過(guò)的FXS 細(xì)胞中其啟動(dòng)子的去甲基化作用恢復(fù)了突變神經(jīng)元的野生型表型.并且在移植到小鼠腦部后，體內(nèi)的編輯神經(jīng)元中FMR1的重新激活得以維持.研究還證明有絲分裂后FXS神經(jīng)元中CGG重復(fù)的去甲基化會(huì)重新激活FMR1，并逆轉(zhuǎn)與FXS 神經(jīng)元相關(guān)的自發(fā)性過(guò)度活躍，即通過(guò)表觀基因組編輯逆轉(zhuǎn)基因失活可能是涉及表觀遺傳沉默的疾病的有效治療策略.

Wu 等［25］使用dCas9-DNMT3a 系統(tǒng)來(lái)精確修飾SAMRCA2啟動(dòng)子的CpG島，評(píng)估SMARCA2啟動(dòng)子甲基化在SMARCA2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用和其在肺癌發(fā)展中的抑癌作用.發(fā)現(xiàn)SMARCA2在肺癌中的表達(dá)下降與拷貝數(shù)缺失和SMARCA2 啟動(dòng)子高甲基化會(huì)導(dǎo)致SMARCA2的失活密切相關(guān).證明SAMRCA2 啟動(dòng)子的超甲基化在肺癌的發(fā)展中起致癌作用，利用CRISPR/dCas9 系統(tǒng)使其去甲基化，為臨床治療提供了潛在靶點(diǎn).

Wang等［26］構(gòu)建了基于dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgRNA的SARI靶向去甲基系統(tǒng)，特異性的對(duì)起抑癌作用的IFN 調(diào)節(jié)的激活蛋白1 的抑制劑（SARI）區(qū)域進(jìn)行去甲基化，證明了結(jié)腸癌中SARI 的下調(diào)依賴DNA 甲基化，進(jìn)一步的體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)證實(shí)，dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CDsgSARI通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤的增殖，凋亡和血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用，對(duì)SARI啟動(dòng)子的特異性去甲基化和恢復(fù)內(nèi)源性SARI表達(dá)具有治療結(jié)腸癌和其他癌癥的作用.

4 應(yīng)用CRISPR/dCas9 系統(tǒng)靶向調(diào)控去甲基化的展望

CRISPR/ dCas9 系統(tǒng)效率高、操作簡(jiǎn)單的特性，使其成為靶向去甲基化編輯特定基因序列的強(qiáng)大工具.簡(jiǎn)單快捷的操作系統(tǒng)和只需設(shè)計(jì)gRNA就可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控，讓CRISPR/dCas9系統(tǒng)備受研究者的青睞，然而目前的實(shí)驗(yàn)證據(jù)發(fā)現(xiàn)，CRISPR/dCas9系統(tǒng)仍存在脫靶效應(yīng)較高的問(wèn)題.雖然應(yīng)用這種方法進(jìn)行靶向DNA 去甲基化還處于起步階段，還需要展開(kāi)大量的實(shí)驗(yàn)研究，但隨著靶向表觀遺傳修飾工具和融合蛋白的不斷開(kāi)發(fā)，高特異性和正確設(shè)計(jì)gRNAs 有望實(shí)現(xiàn)靶向DNA甲基化與去甲基化的精準(zhǔn)調(diào)控，為表觀遺傳學(xué)的發(fā)展提供了新的方法，為表觀疾病的治療提供了可能.