馬蓓潔，賈同樂(lè)，戴冬雪，郝亞茹，韓夢(mèng)思，孫 洋，楊 松，蔡會(huì)欣

(保定市第一中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，河北 保定 071000)

2019新型冠狀病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)是目前發(fā)現(xiàn)的第7種可感染人類(lèi)的冠狀病毒[1]，其感染所致的疾病稱(chēng)為COVID-19(Corona Virus Disease 2019)[2]。COVID-19是以肺部病變?yōu)橹鞯男掳l(fā)傳染病，可引起消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)損傷，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[3]。我國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì)將該病納入《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的乙類(lèi)傳染病，并采取甲類(lèi)傳染病的預(yù)防、控制措施。2020-02-28日，世界衛(wèi)生組織將疫情全球風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別由“高”上調(diào)至“非常高”；2020-3-11日，宣布新冠肺炎疫情進(jìn)入“全球大流行”狀態(tài)[4]。國(guó)際疫情爆發(fā)式增長(zhǎng)，早期診斷、及時(shí)隔離治療對(duì)有效控制疫情至關(guān)重要[5]。

1 新型冠狀病毒肺炎診療方案中有關(guān)實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)的變化

《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第三版)》指出，在符合疑似病例診斷標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等標(biāo)本行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)新型冠狀病毒核酸呈陽(yáng)性結(jié)果或病毒基因測(cè)序與已知新型冠狀病毒高度同源即可確診。第四版中RT-PCR的標(biāo)本類(lèi)型增加血液標(biāo)本；第五版增加糞便標(biāo)本；第六版強(qiáng)調(diào)“為提高核酸檢測(cè)陽(yáng)性率，建議盡可能留取痰液，實(shí)施氣管插管患者采集下呼吸道分泌物，標(biāo)本采集后盡快送檢?！币陨蠋装嬷?，對(duì)疑似病例的確診條件均為找到“病原學(xué)依據(jù)”，即“核酸檢測(cè)陽(yáng)性”或“基因測(cè)序與已知新冠病毒同源”。在2020-03-03日印發(fā)的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中，疑似病例的確診方法在原有核酸檢測(cè)和測(cè)序基礎(chǔ)上增加“血清學(xué)檢測(cè)”，即“新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG抗體陽(yáng)性”或“新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性或恢復(fù)期較急性期4倍及以上升高”[6]。

2 2019-nCoV核酸檢測(cè)的局限性

基因測(cè)序技術(shù)診斷2019-nCoV感染準(zhǔn)確度高，但測(cè)序所需的實(shí)驗(yàn)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，而且設(shè)備要求較高[7]，不適于臨床快速大批量篩查及診斷。RT-PCR核酸檢測(cè)技術(shù)具有高靈敏度和高特異性[8]，但RT-PCR核酸檢測(cè)的結(jié)果受多因素多環(huán)節(jié)的影響[9]，例如試劑盒的準(zhǔn)確性和重復(fù)性[10]、標(biāo)本的類(lèi)型、保存與運(yùn)輸(RNA易降解)、患者感染周期及人員操作等[11]，容易造成病毒核酸檢測(cè)的“假陰性”問(wèn)題。

3 2019-nCoV特異性抗體檢測(cè)

針對(duì)核酸檢測(cè)“假陰性”問(wèn)題，有研究提出應(yīng)補(bǔ)充新冠病毒特異抗體檢測(cè)，抗體協(xié)同核酸檢測(cè)可用于輔助診斷和快速篩查[12]。

3.1 2019-nCoV特異性抗體的產(chǎn)生

通常情況下，機(jī)體感染病毒時(shí)，首先誘發(fā)固有免疫應(yīng)答，通過(guò)I型干擾素抑制病毒，當(dāng)病毒遇到自然殺傷細(xì)胞后，后者通過(guò)細(xì)胞裂解作用將被病毒感染的細(xì)胞清除。但病毒一旦完成入侵并造成感染，便會(huì)誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答。病毒表面分子與宿主細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，機(jī)體針對(duì)病毒表面分子產(chǎn)生特異性抗體。病毒初期感染以誘導(dǎo)IgM抗體產(chǎn)生為主，感染后IgM迅速達(dá)到峰值，但持續(xù)時(shí)間較短，濃度較低，是急性感染期的診斷指標(biāo)；中后期則以誘導(dǎo)IgG抗體產(chǎn)生為主，IgG濃度高，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，即使痊愈后也能長(zhǎng)時(shí)間維持高水平，提示感染中后期或既往感染[12-13]。

一項(xiàng)關(guān)于嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)即非典型肺炎的血清學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，患者發(fā)病后7 d左右血清中出現(xiàn)IgM抗體，10 d時(shí)IgM達(dá)到高峰，15 d左右開(kāi)始下降；發(fā)病后10 d左右血清中出現(xiàn)IgG抗體，20 d左右IgG達(dá)到高峰；另有研究報(bào)道并非所有SARS患者都產(chǎn)生抗體[14]。

SARS病毒的S蛋白可結(jié)合宿主細(xì)胞血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)從而感染細(xì)胞，有研究人員在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ACE2對(duì)2019-nCoV進(jìn)入細(xì)胞也是必需的[15]，而且2019-nCoV與ACE2之間具有很強(qiáng)的親和力[16]。提示我們也許可以根據(jù)SARS抗體研究的結(jié)果推測(cè)2019-nCoV抗體產(chǎn)生的規(guī)律。

有研究[17]報(bào)道了1例COVID-19患者血清抗體水平的變化情況，研究對(duì)象為一名澳大利亞墨爾本市的非重癥COVID-19患者，研究人員對(duì)該患者進(jìn)行了從患病開(kāi)始為期20 d的追蹤觀察。該患者發(fā)病后7 d核酸檢測(cè)轉(zhuǎn)陰，11 d出院隔離，13 d相關(guān)癥狀消失，20 d狀態(tài)良好，并未復(fù)發(fā)。研究者采用感染了2019-nCoV的Vero細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光抗體實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)患者血清中IgG和IgM水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從發(fā)病后7 d到20 d，患者血清中IgG和IgM抗體水平呈逐漸升高的趨勢(shì)[17]。

COVID-19患者發(fā)病后IgM最早何時(shí)產(chǎn)生，徐云云等[18]的研究有所提及。采用免疫熒光法和膠體金法檢測(cè)IgM抗體，發(fā)現(xiàn)IgM抗體最早可在感染后的3 d內(nèi)產(chǎn)生；從病程來(lái)看，發(fā)病1、2、3周及1個(gè)月陽(yáng)性率逐漸升高，1個(gè)月后降低，推測(cè)IgM抗體在感染2019-nCoV后的1周內(nèi)即可產(chǎn)生，并可持續(xù)存在1個(gè)月不消失。但該研究中各病程樣本例數(shù)較少，病程為發(fā)病3 d的病例僅3例，總病例僅80例，尚不能完全反映COVID-19患者體內(nèi)特異性抗體產(chǎn)生及變化規(guī)律。

3.2 特異性抗體的實(shí)驗(yàn)室檢查方法

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了幾種用于輔助診斷2019-nCoV感染的抗體檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)方法包括化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和膠體金法，檢測(cè)指標(biāo)有總抗體、IgM抗體和IgG抗體。

3.2.1 化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光法是將高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合的檢測(cè)方法，用于各種抗原、抗體、激素的檢測(cè)。iFlash 3000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀通過(guò)直接化學(xué)發(fā)光技術(shù)間接免疫法檢測(cè)2019-nCoV IgG/IgM。首先包被2019-nCoV抗原的磁珠和血清樣本中的IgG/IgM抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，隨后與鼠抗人IgG或IgM抗體吖啶酯標(biāo)記物孵育形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物，復(fù)合物濃度與化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度成線(xiàn)性關(guān)系，最后計(jì)算得出抗體濃度?；瘜W(xué)發(fā)光法具有特異性高、線(xiàn)性范圍寬、結(jié)果穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)化等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)[19-20]。

3.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

ELISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合，并根據(jù)酶催化底物產(chǎn)生的顏色反應(yīng)判定相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。Ning等[21]采用雙抗原夾心法和μ鏈捕獲法檢測(cè)總抗體和IgM抗體。邱峰等[22]指出ELISA法的實(shí)驗(yàn)室操作要求相對(duì)較低，適用于篩查及流行病學(xué)調(diào)查，但其敏感性、特異性、臨床應(yīng)用效率還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證和評(píng)估。

3.2.3 膠體金法

膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體檢測(cè)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。血清中的2019-nCoV IgG/IgM抗體與膠體金標(biāo)記的2019-nCoV抗原結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物在包被的鼠抗人IgG/IgM抗體處被捕獲，與之結(jié)合形成復(fù)合物，呈現(xiàn)紫紅色條帶。膠體金技術(shù)具有方便快捷、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn),特別適合于基層檢驗(yàn)及大批量檢測(cè)等[23]。

3.3 不同方法檢測(cè)2019-nCoV特異性抗體靈敏度和特異性的差異

唐鵬等[24]將191例就診于武漢雷神山醫(yī)院的確診和疑似COVID-19患者按照入院及實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的核酸檢測(cè)結(jié)果分為3組：2019-nCoV持續(xù)陽(yáng)性組、2019-nCoV陽(yáng)轉(zhuǎn)陰組及2019-nCoV疑似組，采集血清樣本，分別采用膠體金法和化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)各組IgM和IgG總抗體及IgM抗體。結(jié)果表明，持續(xù)陽(yáng)性組膠體金法和化學(xué)發(fā)光法總抗體陽(yáng)性檢出率無(wú)明顯差異；陽(yáng)轉(zhuǎn)陰組和疑似組化學(xué)發(fā)光法總抗體陽(yáng)性檢出率明顯高于膠體金法(95.2% vs 76.2%，94.9% vs 70.5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ning等[21]采用3種方法(化學(xué)發(fā)光法、ELISA法和膠體金法)檢測(cè)總抗體和IgM抗體，發(fā)現(xiàn)這3種方法檢測(cè)總抗體和IgM的敏感性和特異性均較高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。徐云云等[18]采用熒光免疫法和膠體金法分別對(duì)COVID-19患者和對(duì)照人群(2019-nCoV流行期間經(jīng)臨床診斷排除COVID-19者)血清IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示熒光免疫法檢測(cè)總陽(yáng)性率略高于膠體金法(88.75% vs 81.25%)。上述方法均具有操作方便、高效快捷、高敏感性的特點(diǎn)，但唐鵬等[24]和Ning等[21]的研究結(jié)果有一定的差異，推測(cè)原因可能是兩項(xiàng)研究中患者采血時(shí)間不同，唐鵬等的研究按照病程分組，而Ning等的研究未注明患者病程情況。

3.4 血清總抗體檢測(cè)在2019-nCoV感染中的篩查診斷價(jià)值

Zhao等[25]采用雙抗原免疫夾心法、IgM μ-chain捕獲法和間接ELISA法對(duì)173例COVID-19確診患者發(fā)病后不同時(shí)間點(diǎn)的535個(gè)血清標(biāo)本進(jìn)行總抗體、IgM抗體和IgG抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)血清中總抗體、IgM抗體、IgG抗體的血清轉(zhuǎn)化依次出現(xiàn)，中位時(shí)間分別為11、12、14 d，即總抗體的平均血清轉(zhuǎn)化時(shí)間分別比IgM抗體和IgG抗體早1 d和3 d，提示總抗體較IgM抗體和IgG抗體可能是更好的血清學(xué)診斷指標(biāo)，可用于早期篩查或診斷。唐鵬等[24]的研究中，患者起病時(shí)間到抗體采集時(shí)間總中位數(shù)為25 d，范圍為3～47 d，表明患者病程分布較廣，但總抗體檢測(cè)仍表現(xiàn)出較好的診斷陽(yáng)性率[24]，提示總抗體在不同病程中均具有篩查或診斷價(jià)值。

4 血清抗體聯(lián)合核酸檢測(cè)在2019-nCoV感染診斷中的應(yīng)用價(jià)值

病毒感染機(jī)體后，通過(guò)激活B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，需要一定時(shí)間，從而形成抗體檢測(cè)的“空窗期”，且由于個(gè)體差異，不同個(gè)體“空窗期”的時(shí)間亦有所不同[18]。早期IgM抗體可能還未產(chǎn)生或呈低濃度水平，抗體檢測(cè)可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果；隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，IgM抗體亦逐漸減少甚至消失。因此，在抗體檢測(cè)的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用RT-PCR核酸檢測(cè)，可顯著提高不同病程COVID-19患者的檢出率。

Zhao等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在COVID-19發(fā)病7 d內(nèi)的早期階段，RT-PCR核酸檢測(cè)的敏感性遠(yuǎn)高于抗體檢測(cè)(66.7% vs 38.3%)；但從發(fā)病第8天開(kāi)始，抗體檢測(cè)的敏感性就超過(guò)了核酸檢測(cè)，發(fā)病第12天達(dá)到90%以上；在發(fā)病8～14 d的患者樣本中，總抗體、IgM和IgG的敏感性分別為89.6%、73.3%和54.1%，均高于核酸檢測(cè)的54.0%；在發(fā)病15～39 d的晚期階段，總抗體、IgM和IgG的敏感性分別為100.0%、94.3%和79.8%，而核酸檢測(cè)敏感性?xún)H為45.5%。因此，在COVID-19的診療過(guò)程中，核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)互為彌補(bǔ)，聯(lián)合檢測(cè)有利于2019-nCoV的篩查、確診及治療。

5 小 結(jié)

抗體檢測(cè)具有采樣方便、快速高效、高敏感性和高特異性的特點(diǎn)，在對(duì)2019-nCoV感染者進(jìn)行篩查或診斷時(shí)，可根據(jù)患者病程選擇合適的抗體檢測(cè)方法，同時(shí)聯(lián)合核酸檢測(cè)，可顯著提高不同病程COVID-19患者診斷的敏感性及2019-nCoV感染的篩查及診斷效率。