武傳佳，高菁菁，武 杰，陳旭東，孫佰順

（1.吉林市中心醫(yī)院，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；3.長春理工大學(xué)（國家納米操縱與制造國際聯(lián)合研究中心），吉林 長春 130022）

消化系統(tǒng)的癌癥是臨床上癌癥發(fā)病率較高的一種癌癥，大腸癌患者在消化系統(tǒng)癌癥患者的比例較高，尤其是70歲以上人群高發(fā)癌癥一種[1]。大腸癌癥患者經(jīng)過積極手術(shù)和化療治療還是有較高的生存率的[2]?；熕幬锏挠昧亢秃Y選是癌癥患者治療效果的關(guān)鍵因素。但由于患者自身對化療藥物耐藥性各有不同，如何對每一個患者進(jìn)行精準(zhǔn)用藥是臨床上面臨的一個很大的挑戰(zhàn)[3]。

上個世紀(jì)八十年代初，第一臺AFM研制成功，使人們可以實(shí)現(xiàn)對液相的樣品進(jìn)行三維形貌成像[4]。由于AFM能夠許多醫(yī)學(xué)樣本材料進(jìn)行掃描成像[5]，為醫(yī)學(xué)研究開辟了一條新的研究方向，使得AFM很快成為了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域科學(xué)研究的一種有效工具[6-7]。例如，AFM可以在液相下，對活體細(xì)胞進(jìn)行掃描成像[8]，這可以測量活體細(xì)胞的很多物理學(xué)特性[9-10]，為醫(yī)學(xué)研究提供新的途徑，已經(jīng)逐漸成為醫(yī)學(xué)研究中一種重要的研究工具[11]。本文利用原子力顯微鏡（AFM）對普通的大腸癌細(xì)胞HT-29和經(jīng)過抗癌藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）耐藥處理的大腸癌細(xì)胞株HCT-8/5-FU加入抗癌藥物5-FU后0h、3h、6h進(jìn)行掃描成像。對AFM掃描的圖像的粗糙度進(jìn)行對比，以便找到普通的大腸癌細(xì)胞HT-29和經(jīng)過抗癌藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）耐藥處理的大腸癌細(xì)胞株HCT-8/5-FU加入抗癌藥物5-FU后0 h、3 h、6 h的差別。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將大腸癌細(xì)胞HT-29和HCT-8分別用10%的胎牛血清（FBS，Hy Clone）的RPMI-1640培養(yǎng)液（Hy Clone）進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)置為溫度為37°、CO2含量為5%。每天更換一次培養(yǎng)液，在HCT-8細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿基底大約80%時，加入500 ng/ml的5-FU，24 h后大約70%左右的細(xì)胞死亡，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）輕輕沖洗死亡的細(xì)胞和5-FU殘留藥物。再用10%的胎牛血清（FBS，Hy Clone）的RPMI-1640培養(yǎng)液（Hy Clone）重新培養(yǎng)到鋪滿基底大約80%時，再次以梯度為500ng/ml的方式增加藥物濃度，連續(xù)培養(yǎng)直至5-FU的濃度為15ug/ml且細(xì)胞能夠穩(wěn)定生長，該細(xì)胞即為耐藥細(xì)胞HCT-8/5-FU。

1.2 掃描成像

取6孔培養(yǎng)板先加入經(jīng)過高溫蒸汽消毒的蓋玻片，每孔1片，與培養(yǎng)皿底部貼牢固定，再加入細(xì)胞數(shù)為1×105/ml的HT-29和HCT-8/5-FU的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)12h后，采用AFM（JPK NanoWizard@ 3 BioScience）使用探針ContAl-G（Budget Sensors）對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行接觸式掃描成像。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用AFM對加入5-FU后HT-29和HCT-8/5-FU的0 h、3 h、6 h進(jìn)行掃描成像。HT-29細(xì)胞加藥作用后，細(xì)胞高度曲線變得不平整，HCT-8/5-FU細(xì)胞加藥作用后，細(xì)胞表面還是比較平滑，褶皺比較少。

3 圖像數(shù)據(jù)分析

對AFM掃描的HT-29細(xì)胞的圖像進(jìn)行分析，獲得大腸癌細(xì)胞HT-29加藥0 h、3 h、6 h時的一些數(shù)據(jù)，如表1所示，細(xì)胞高度分別為5.56±0.65 um、6.47±0.35 um、4.53±0.89 um長度為35.57±3.45 um、24.53±2.55 um、20.23±2.37 um，寬度為27.53±2.75 um、23.51±2.63 um、19.54±1.63 um，粗糙度分別為94.57±18.62 um、156.39±39.54 um、205.37±14.53 um。從以上數(shù)據(jù)可以看出隨著藥物作用時間增加，HT-29細(xì)胞的高度、長度、寬度、粗糙度都發(fā)生了變化，但粗糙度變化的趨勢明顯。

表1 5-FU作用HT-29細(xì)胞不同時間后細(xì)胞高度、長度、寬度和粗糙度變化

對AFM掃描的HCT-8/5-FU細(xì)胞的圖像進(jìn)行分析，獲得大腸癌細(xì)胞HCT-8/5-FU加藥0h、3h、6h時的一些數(shù)據(jù)，如表2所示，細(xì)胞高度分別為5.31±0.45 um、4.84±0.67 um、4.95±0.63 um長度為35.63±3.24 um、33.46±3.82 um、34.67±5.63 um，寬度為26.83±3.48 um、23.53±2.35 um、22.56±2.15 um，粗糙度分別為139.47±25.41 um、138.46±23.43 um、142.13±31.45 um。從以上數(shù)據(jù)可以看出隨著藥物作用時間增加，HCT-8/5-FU細(xì)胞的高度、長度、寬度、粗糙度都發(fā)生了變化，但變化的趨勢不明顯，可作為藥物評價的一個重要指標(biāo)。

經(jīng)AFM掃描圖像的數(shù)據(jù)分析大腸癌細(xì)胞HT-29在5-FU作用后的高度、長度、寬度、粗糙度四個客觀數(shù)值比較，粗糙度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。耐藥細(xì)胞HCT-8/5-FU在5-FU作用后的高度、長度、寬度、粗糙度四個客觀數(shù)值比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HT-29和HCT-8/5-FU細(xì)胞在用藥0h、3h、6h，只有HT-29加藥后的粗糙度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05）。上述結(jié)果表明細(xì)胞粗糙度可作為HT-29和耐藥株HCT-8/5-FU的耐藥性篩查的統(tǒng)計(jì)學(xué)的一項(xiàng)指標(biāo)。

4 結(jié) 論

利用AFM對加藥后不同時間段的大腸癌細(xì)胞HT-29和經(jīng)過5-FU耐藥處理的HCT-8/5-FU的細(xì)胞進(jìn)行掃描成像。通過對AFM掃描的圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得出細(xì)胞的高度、長度、寬度、粗糙度的四個客觀數(shù)據(jù)，并對以上四個客觀數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出大腸癌細(xì)胞HT-29在加藥后0 h、3 h、6 h的細(xì)胞的粗糙度具有較好的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05）。利用AFM掃描成像的細(xì)胞粗糙度可作為大腸癌藥物耐藥性篩查的一項(xiàng)指標(biāo)，對于臨床上抗癌藥物的耐藥性研究具有一定參考價值。