王一凡 張璇 李軍

淫羊藿苷(Icariin，ICA)是淫羊藿的主要提取物，具有加速細(xì)胞周期和促進(jìn)骨髓干細(xì)胞成骨分化的作用[1-5]。近年來，細(xì)胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)因其獨(dú)特的生物化學(xué)性質(zhì)備受關(guān)注[6-7]。外泌體能負(fù)載蛋白質(zhì)、脂類、核酸和植物提取物，并通過這些功能性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間物質(zhì)交換和信息傳遞[8]。本研究選用具有歸巢潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞作為母細(xì)胞，首次將淫羊藿苷負(fù)載于外泌體中來實(shí)現(xiàn)ICA的緩釋，明確ICA-EVs對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的成骨分化作用，為ICA的成骨應(yīng)用提供新思路。

1 材料及方法

1.1 材料

ICA從美國馬薩諸塞州沃本市LC實(shí)驗(yàn)室購買，小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。親脂性熒光染料1，1′-十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚碳菁高氯酸鹽(DIL)和分子探針購于美國俄勒岡州尤金市。6-二氨基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)和Triton X-100從Sigma-Aldrich(美國密蘇里州圣路易斯市)獲得。細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco生命科技公司。熒光聚苯乙烯(熒光最大值G100)來自賽默飛世爾科技公司(美國)。

1.2 EVs分離

從分化的小鼠成骨細(xì)胞中分離出EVs。在成骨細(xì)胞第6天，更換培養(yǎng)基，并在第7天收集培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基分別以300g離心5 min和2×104g離心20 min，去除細(xì)胞和較小的細(xì)胞碎片。收集的上清液通過聚醚砜膜過濾器(0.22 μm，美國康寧)并以1×105g離心60 min。用PBS沖洗顆粒并重新離心(1×105g離心60 min)。懸浮在無菌PBS中的顆粒在4 ℃下保存，直到進(jìn)一步使用。

1.3 ICA-EVs的制備

使用超聲法將ICA裝載到EVs中，將ICA和EVs混合物使用505型超聲去膜器進(jìn)行超聲處理，設(shè)置如下：20%振幅，6個周期30 s開/關(guān)，持續(xù)3 min，每個周期之間有2 min的冷卻期。超聲處理后，ICA-EVs溶液在37 ℃下孵育60 min，以恢復(fù)外體膜。使用NAP-10 Sephadex G25柱(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，英國)通過大小排阻色譜法從ICA-EVs分離多余的游離藥物。

1.4 ICA-EVs的透射電鏡觀察

為了進(jìn)行電子顯微鏡研究，將5 μL等分的ICA-EVs制劑放置在碳涂層的200目銅網(wǎng)格上，在室溫下放置20 min。在PBS中用1%戊二醛固定5 min，用2%磷鎢酸水溶液復(fù)染。使用JEOL-JEM-1400+電子顯微鏡，在80 kV下檢查。

1.5 ICA含量及釋放曲線

用高效液相色譜(HPLC)法測定EVs中ICA的含量，即將微離心管中的ICA-EVs(10 100個/mL)放置在設(shè)定為75 ℃的加熱塊上以蒸發(fā)溶劑。然后，加入等量乙腈，對混合物進(jìn)行渦流、超聲處理，然后以1.3×104r/min離心10 min。離心后取上清液，通過2 μm濾器過濾，轉(zhuǎn)移到高效液相色譜自動進(jìn)樣瓶中。在高效液相色譜系統(tǒng)(安捷倫1200，美國)中注入20 μL等份。所有分析均采用C18柱(Supelco Nuclosil C18，250 mm×4.6 mm，5 μm，10 nm，Sigma-Aldrich)進(jìn)行，流動相為H2O∶乙腈(45∶55)，30 ℃下流速為1 mL/min。在270 nm處測量吸光度以監(jiān)測ICA的洗脫。

為了測量ICA釋放量，將新制備的ICA-EVs放置于PBS中，在RT條件下進(jìn)行洗滌并攪拌。在透析管內(nèi)的時間點(diǎn)取樣，并按上述方法用高效液相色譜法進(jìn)行分析。從ICA-EVs釋放的ICA量表示為總ICA的百分比，并繪制為時間的函數(shù)。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

所有實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院動物護(hù)理與實(shí)驗(yàn)委員會批準(zhǔn)。取4周齡SD大鼠股骨和脛骨的BMSCs。簡單地說，股骨中段和脛骨的骨髓被沖洗出來，懸浮在完全培養(yǎng)基中(CM，α-MEM，Gibco，美國)，添加10%胎牛血清(FBS，Gibco，美國)和1%青霉素/鏈霉素(Gibco，美國)。48 h后取出非貼壁細(xì)胞。第2代BMSCs用于以下實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞在37 ℃含5%二氧化碳的加濕空氣中培養(yǎng)。

1.7 ICA-EVs的成骨作用

培養(yǎng)基中含有20 μmol/L的ICA和ICA-EVs。BMSCs在室內(nèi)接種，每2 d更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)4周。誘導(dǎo)成骨后，用ARS測定鈣沉積，證實(shí)分化。細(xì)胞經(jīng)ARS染色20 min，DW洗滌，光學(xué)顯微鏡成像。隨后，在10 mmol/L磷酸鈉中加入10%氯化十六烷基吡啶，將溶液在25 ℃下孵育15 min。在562 nm處用微孔板閱讀器測量ARS提取。

1.8 ELISA檢測 Runx2及β-catenin含量

將ICA，EVs，ICA-EVs 分別接種于含有MSCs的12孔板中，細(xì)胞接種方法同上。12孔板分別培育3，7，14 d。應(yīng)用 ELISA檢測試劑盒，酶標(biāo)儀波長480 nm測定A值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及A值，計(jì)算實(shí)驗(yàn)樣本待測蛋白濃度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P值為雙側(cè)，經(jīng)Bonferroni校正，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICA-EVs的制備和表征

TEM檢測結(jié)果顯示ICA-EVs囊泡呈圓形，粒徑分布較窄，平均粒徑為(244.4±4.2)nm，見圖1。

2.2 ICA載藥量及釋放曲線

用紫外可見吸收光譜法在270 nm波長處測量乙腈溶液中ICA的濃度，計(jì)算ICA-EVs中ICA的最大載藥量為27.83%。如圖2所示，ICA-EVs在生理鹽水中浸泡10 h后，出現(xiàn)約56.4%的快速釋放，隨后的ICA-EVs釋放行為趨向于平衡。

2.3 ICA-EVs上BMSCs的成骨分化作用

使用含有20 μmol/L的ICA和ICA-EVs培養(yǎng)基誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，并在1，2，3周進(jìn)行ARS染色以評估在有無ICA的EVs上生長的BMSCs的成骨細(xì)胞分化。在最初的7 d中，成骨細(xì)胞礦化沒有明顯增加(見圖3)。但是在分化兩周后，差異是明顯的，尤其是在第7天和第14天之間(見圖3)。在第14天和第21天，ICA-EVs中的BMSCs向成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化分別比ICA組高120%和160%。

圖1ICA-EVs的TEM及粒徑分布圖

圖2ICA在50 h內(nèi)的釋放曲線

2.4 ICA-EVs復(fù)合物對ALP mRNA表達(dá)量的影響

實(shí)驗(yàn)組與空白對照組對ALP mRNA表達(dá)的影響差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) (見表1) 。ALP是BMSCs早期成骨分化的重要標(biāo)志，在細(xì)胞外基質(zhì)礦化過程中具有重要的作用。本研究對12孔板中培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行ALP染色，成骨誘導(dǎo)第3，7，14天行ALP染色分析均為陽性。ICA組和ICA-EVs在第7天和第14天顯示出高于對照組的表達(dá)量，ICA-EVs在第7天其ALP表達(dá)量顯著高于ICA，EVs未顯示出促進(jìn)ALP表達(dá)水平提高的作用。

圖3ICA-EVs的促成骨分化作用

表1 ICA-EVs復(fù)合物對BMSCs ALP表達(dá)的影響

2.5 ICA-EVs復(fù)合物對BMSCs中β-catenin表達(dá)的影響

ICA組僅在第3天時和對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (見表2)，第7天和第14天時與空白對照組和EVs組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

ICA-EVs在第3，7，14天，和對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在第3天其β-catenin活性和ICA組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 ICA-EVs復(fù)合物對BMSCs 中β-catenin表達(dá)的影響

2.6 ICA-EVs復(fù)合物對BMSCs 細(xì)胞Runx2表達(dá)的影響

ICA組僅在第3天和第7天時與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (見表3)，第14天時均未顯示出和空白對照組及EVs組的顯著差異。ICA-EVs在第3，7，14天和空白對照組、EVs組、ICA組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在第14天其Runx2活性和ICA組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 ICA-EVs復(fù)合物對BMSCs中Runx2表達(dá)的影響

3 討論

外泌體兼具細(xì)胞基藥物遞送和納米結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)，能有效突破各種生物屏障實(shí)現(xiàn)藥物的高效轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。在本研究中，筆者利用溫和的超聲處理制備載藥體系，得到載藥量較高的納米復(fù)合物。這可能由于超聲處理降低了外體膜的剛性，從而允許ICA進(jìn)入脂質(zhì)雙層，從而提高了載藥量。雖然超聲波能顯著減低外體膜的微粘度[10]。但不排除在外顯體表面也有大量ICA黏附的可能，這是前10 h觀察到ICA突釋的原因。當(dāng)外泌體膜與細(xì)胞或內(nèi)體膜融合時，其管腔內(nèi)的ICA可釋放到靶細(xì)胞的胞漿中。其次，ICA-EVs制劑的穩(wěn)定性對其臨床應(yīng)用至關(guān)重要。本研究制備的ICA-EVs制劑可以在25 ℃穩(wěn)定存儲超過1個月，和此前關(guān)于外泌體穩(wěn)定性的研究相符[11]。

在骨質(zhì)疏松癥患者中，由于BMSCs的增殖和成骨分化減少，骨形成和降解平衡被破壞，導(dǎo)致骨再生能力有限。植物中提取的黃酮類化合物，如淫羊藿苷、染料木素和大豆黃酮，被證明能刺激骨骼形成[12]。由于淫羊藿苷在體外24 h對成骨細(xì)胞分化和礦化的促進(jìn)作用強(qiáng)于染料木素，本研究選擇淫羊藿苷作為骨修復(fù)劑，觀察其骨修復(fù)作用。本研究制備的ICA-EVs制劑可以誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化。在納米制劑中生長的BMSCs在第14～21天之間顯示出增加的成骨礦化能力，比游離ICA高1.2倍，顯示加速干細(xì)胞成骨的潛力。

ALP是BMSCs細(xì)胞外基質(zhì)成熟的早期標(biāo)志物，該酶的活性高低可以用來檢測早期成骨細(xì)胞的含量及分化程度[13]，β-catenin主要在骨細(xì)胞增殖期表達(dá)，二者的表達(dá)在一定程度上反映了骨形成進(jìn)程，是BMSCs分化成熟的重要標(biāo)志。Runx2基因位于人類常染色體6p21位點(diǎn)，屬于Runt域基因家族的轉(zhuǎn)錄因子之一。研究證實(shí)，Runx2能夠激活骨鈣素、骨橋蛋白等成骨相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[14]，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠在胚胎發(fā)育期內(nèi)可見顱骨、軀干骨和四肢骨的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在Runx2表達(dá)，而在已分化的骨和軟骨細(xì)胞中檢測不到[15]。故Runx2屬于Runx蛋白家族，是一種能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化、成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在骨修復(fù)與重建中發(fā)揮重要作用[16-17]本實(shí)驗(yàn)通過檢測ALP及β-catenin，Runx2的表達(dá)，研究 ICA-EVs復(fù)合物對BMSCs分化的影響，與空白對照組相比，ICA-EVS復(fù)合物在各檢測時間點(diǎn)ALP活性增高，β-catenin及Runx2表達(dá)增加，說明 ICA-EVs復(fù)合物對BMSCs的成熟分化有促進(jìn)作用并且這種作用可以維持到第14天甚至更長。ICA-EVs復(fù)合物對ALP，β-catenin，Runx2的促進(jìn)作用優(yōu)于ICA。

與空白對照組和EVs組相比，其余各組ALP表達(dá)均有增加，ICA-EVs復(fù)合物在第3，7，14天，BMSCs，Runx2，β-catenin的表達(dá)均顯著高于對照組，促進(jìn)BMSCs分化方面其效果顯著優(yōu)于ICA組。結(jié)果證明ICA-EVs在引導(dǎo)BMSCs成骨誘導(dǎo)方面的優(yōu)越性，對于干細(xì)胞療法及骨組織改建具有重要意義。

ICA-EVs在干細(xì)胞研究中顯示出巨大的發(fā)展前景，基于筆者的研究結(jié)果，EVs還可以通過結(jié)合不同類型的納米材料(如聚苯乙烯珠、玻璃珠)和肽(環(huán)RGD肽、iRGD肽)來改善平臺。其他類型的干細(xì)胞，如多能干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞，也可用于研究ICA-EVs的成骨誘導(dǎo)潛力。利用EVs復(fù)合物作為培養(yǎng)制劑，從不同的干細(xì)胞系中獲得所需的細(xì)胞類型，將有助于臨床研究，特別是用于人體器官/組織損傷部位的再生。綜上所述，課題組制備的ICA-EVs有望在干細(xì)胞骨再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域做出貢獻(xiàn)。