陳巍巍，單偉

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科一病區(qū)；2.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展的快速增加，物質(zhì)的日漸豐富，人們生活節(jié)奏也前所未有的加快。因此，不同程度的焦慮等神經(jīng)或精神癥狀也日漸增多。報(bào)道顯示，10%～15% 的成年人符合失眠癥臨床標(biāo)準(zhǔn)[1]。另外，失眠癥造成的間接后果性損害(如工傷、病假等)明顯大于直接損害(如失眠癥治療所需費(fèi)用等)[2]。因此，安全有效的鎮(zhèn)靜催眠藥物一直是臨床和基礎(chǔ)研究者的研發(fā)熱點(diǎn)之一。我國(guó)傳統(tǒng)經(jīng)典藥物棗仁安神膠囊單獨(dú)應(yīng)用或者聯(lián)合其他藥物使用對(duì)失眠癥患者、冠心病伴焦慮抑郁患者的臨床效果較好[3-6]，但對(duì)該藥的相關(guān)機(jī)制研究尚少見(jiàn)。基于此，本組資料棗仁安神膠囊對(duì)小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用和機(jī)制進(jìn)行探討，為該藥的應(yīng)用和機(jī)制提供理論依據(jù)，以期為失眠癥治療提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物

棗仁安神膠囊(貴州同濟(jì)堂制藥有限公司批號(hào)131202)，陽(yáng)性對(duì)照藥(康斯頓廣州萬(wàn)康保健品有限公司，20180311；巴比妥鈉(EXP:20190221)、戊巴比妥鈉(EXP:20190311)，sigma公司。A1R和A2AR抗體，cy3標(biāo)記二抗。

1.2 動(dòng)物

昆明種小鼠，雄性，體重18～22 g。許可證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001。

1.3 儀器

石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡LEICA-RM2135)、流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司FACS Calibur)、熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(以色列MF-ChemiBIS3.2)、光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，bx60日本)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與給藥

實(shí)驗(yàn)分4組：空白對(duì)照組、棗仁安神膠囊低、中、高劑量組(0.19、0.38、0.76 g/kg)，康斯頓陽(yáng)性組(0.45 g/kg)，連續(xù)30 d，灌胃給藥，每10 g用藥0.2 mL。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始與結(jié)束，記錄并分析體重。給藥30 d后，取肝臟、腎臟，常規(guī)石蠟切片，蘇木素-伊紅染色(HE)。

2.2 直接睡眠實(shí)驗(yàn)

空白對(duì)照組給予同體積溶劑后，是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。睡眠以翻正反射消失為指標(biāo)，當(dāng)小鼠置于背臥位時(shí)，能立即翻正身位。如超過(guò)30～60 s不能翻正者，即認(rèn)為翻正反射消失，進(jìn)入睡眠。翻正反射恢復(fù)即為動(dòng)物覺(jué)醒，翻正反射消失至恢復(fù)這段時(shí)間為動(dòng)物睡眠時(shí)間，記錄入睡動(dòng)物數(shù)及睡眠時(shí)間。

2.3 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)[7]

正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定使動(dòng)物100%入睡，但又不使睡眠時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的戊巴比妥鈉劑量，用此劑量正式試驗(yàn)。在末次灌胃15 min后，給各組動(dòng)物按90 mg/kg(依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)ip戊巴比妥鈉(10 mL/kg)，以小鼠翻正反射消失為睡眠指標(biāo)，記錄睡眠時(shí)間。

2.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)

確定戊巴比妥鈉閾下催眠劑量40 mg/kg，即80%～90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥鈉最大閾下劑量。用此劑量進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。在末次給藥15 min后，給各組動(dòng)物按40 mg/kg(依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)ip戊巴比妥鈉(10 mL/kg)，以小鼠翻正反射消失達(dá)1 min以上作為入睡判斷標(biāo)準(zhǔn)，記錄30 min內(nèi)各組入睡動(dòng)物數(shù)和睡眠發(fā)生率。

2.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期[8]

確定使動(dòng)物100%入睡，但又不使睡眠時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的巴比妥鈉劑量230 mg/kg，用此劑量正式試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在末次灌胃15 min后，給各組動(dòng)物按230 mg/kg ip巴比妥鈉(10 mL/kg)，以小鼠翻正反射消失為指標(biāo)，觀察睡眠潛伏期。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠腦組織中A1R和A2AR

末次給藥30 min后，取空白對(duì)照組、棗仁安神膠囊高劑量組小鼠腦組織，一半用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，一半用于蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)。研磨為勻漿，用移液器反復(fù)吹散，過(guò)濾，離心，去除上清。按照說(shuō)明書(shū)，按1∶100的比例稀釋A1R和A2AR抗體，加入腦組織，洗滌，加入二抗，再次洗滌。上樣流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。Western Blot參考[9]，常規(guī)裂解、離心、變性、轉(zhuǎn)模、孵育，β-actin為內(nèi)參。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié) 果

3.1 形態(tài)學(xué)檢測(cè)和體重的結(jié)果

棗仁安神膠囊及對(duì)照組動(dòng)物在給予棗仁安神膠囊60 min內(nèi)，均未發(fā)生直接睡眠現(xiàn)象。給藥期間小鼠腹瀉、自主活動(dòng)、皮毛等方面未見(jiàn)異常，肝臟、腎臟病理切片與空白組比較無(wú)異常，見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)前，根據(jù)小鼠體重隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組小鼠的體重比較，差異不顯著，即藥物對(duì)小鼠的體重增長(zhǎng)無(wú)影響，見(jiàn)表1。

表1 棗仁安神膠囊對(duì)小鼠體重的影響

圖1 肝臟和腎臟組織病理圖(HE染色)

3.2 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響

與空白對(duì)照組比較，棗仁安神膠囊高劑量組睡眠發(fā)生率明顯增加，差異顯著。棗仁安神膠囊低、中劑量組、陽(yáng)性組延長(zhǎng)睡眠時(shí)間，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明棗仁安神膠囊能延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間，見(jiàn)表2。

3.3 巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

與空白對(duì)照組比較，棗仁安神膠囊高劑量組睡眠潛伏期明顯減少。低、中劑量組降低睡眠潛伏期，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明棗仁安神膠囊能減少巴比妥鈉睡眠潛伏期，見(jiàn)表3。

3.4 小鼠腦組織中A1R和A2AR表達(dá)

流式和Western Blot檢測(cè)顯示：棗仁安神膠囊高劑量組與對(duì)照組比較，A1R和A2AR表達(dá)明顯增高，見(jiàn)圖2。

表2 棗仁安神膠囊對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠體重睡眠時(shí)間的影響

表3 棗仁安神膠囊對(duì)小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖；B、C：Western Blot的方法檢測(cè)結(jié)果(*P < 0.05與空白對(duì)照組相比)

4 討 論

失眠癥指的是由于多種原因所引起的經(jīng)常性睡眠減少，或者睡而易醒，醒后無(wú)法再次入睡，或者這不容易入睡，睡眠時(shí)間縮短，甚至徹夜難眠的一種病證。棗仁安神膠囊由酸棗仁(炒)、丹參、五味子(醋炙)組成，功效重點(diǎn)在補(bǔ)陰、斂陰，即滋補(bǔ)腎水，收斂肝陰，調(diào)節(jié)肝腎功能，達(dá)到體內(nèi)陰陽(yáng)平衡，養(yǎng)心安神的目的，可有效治療失眠癥。本研究首先考察了棗仁安神膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠體重的影響。結(jié)果提示，受試藥物對(duì)小鼠體重?zé)o影響，從體重增長(zhǎng)角度和病理實(shí)驗(yàn)證實(shí)該藥物對(duì)生長(zhǎng)情況沒(méi)有影響。給藥期間，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹瀉、自主活動(dòng)、皮毛等方面未見(jiàn)異常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明了中藥棗仁安神膠囊對(duì)生長(zhǎng)情況及器官臟器安全性。目前，很多報(bào)道顯示棗仁安神膠囊對(duì)失眠癥患者臨床效果良好。本實(shí)驗(yàn)從入睡情況和睡眠時(shí)間上分別考察了棗仁安神對(duì)睡眠的影響，結(jié)果顯示棗仁安神膠囊具有改善睡眠的作用。與臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[3]167-168。本文采用陽(yáng)性藥康斯頓牌改善睡眠膠囊作為對(duì)照，主要成分酸棗仁提取物、遠(yuǎn)志提取物、牡蠣粉、茯苓提取物、百合提取物、硬脂酸鎂；保健功能：改善睡眠；適宜人群：睡眠狀況不佳者。該藥物主要成分與我們受試藥物相似，都含有酸棗仁，與受試藥物都屬于中成藥，故選作陽(yáng)性藥物。關(guān)于睡眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該陽(yáng)性藥物在推薦劑量下對(duì)小鼠有作用趨勢(shì)，無(wú)顯著性差異?？赡艿脑?，我們推測(cè)可能由于實(shí)驗(yàn)中采用的陽(yáng)性藥劑量對(duì)戊巴比妥鈉、巴比妥鈉干預(yù)下的睡眠作用影響不明顯。

臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)對(duì)于棗仁安神的藥效學(xué)研究并不少見(jiàn)，但是對(duì)其作用機(jī)制研究尚不多見(jiàn)。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot檢測(cè)腦內(nèi)蛋白的表達(dá)，對(duì)其改善睡眠的作用進(jìn)一步探討。腺苷是一種內(nèi)源性的促進(jìn)睡眠的物質(zhì)[10]。據(jù)報(bào)道，在長(zhǎng)時(shí)間的覺(jué)醒過(guò)程中，大腦特定區(qū)域中腺苷酸的分泌增加，這對(duì)增加睡眠內(nèi)穩(wěn)態(tài)起著非常重要的作用[11]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示腺苷和穩(wěn)定的腺苷類似物證明可以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物入睡[12]。腺苷在生理濃度，通過(guò)膜受體結(jié)合級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的腺苷受體有四種亞型:A1R、A2AR、A2BR和A3R。其中，A1R和A2AR與睡眠調(diào)節(jié)相關(guān)[13]。近年來(lái)，對(duì)有關(guān)腺苷與鎮(zhèn)靜催眠關(guān)系以及與腺苷和腺苷受體相關(guān)的藥物研究日漸深入，研制腺苷受體相關(guān)鎮(zhèn)靜安眠藥物[14-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示棗仁安神膠囊高劑量組腦內(nèi)A1R和A2AR表達(dá)增加，提示棗仁安神膠囊可能通過(guò)提高A1R和A2AR而發(fā)揮作用。關(guān)于棗仁安神膠囊通過(guò)何種信號(hào)通路對(duì)腺苷受體發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討棗仁安神膠囊的催眠作用及可能機(jī)制。結(jié)果顯示，棗仁安神膠囊無(wú)論在增加睡眠時(shí)間還是縮短入睡時(shí)間方面均具有改善作用，并且可能與提高A1R和A2AR有關(guān)。