李彥榮，劉光煒，趙 晶，李亞軍

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)(定西校區(qū))，甘肅 定西 743000； 2.定西市人民醫(yī)院 檢驗科，甘肅 定西 743000)

雄性動物的血清、睪丸網(wǎng)以及精液中都存在著一定濃度的雌激素，而以睪丸網(wǎng)液中的雌激素水平為高，甚至可以達(dá)到250 ng/L，雌激素對雄性生殖系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能的維持也起著非常重要的作用[1]。多種因素會導(dǎo)致睪丸損傷，如：鎘、射線、高溫和氧自由基等，這些因素使睪丸Leydig細(xì)胞受到損傷，這種損傷影響到精子的生成，導(dǎo)致男性生殖功能障礙，男性不育癥患者逐年增多[2-4]。黃芪是中國傳統(tǒng)的中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongho licus (Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，味甘、微溫、歸肺和脾經(jīng)[5]，具有補中益氣，扶正固本之功效。黃芪中主要成分:總黃酮(Astragalus flavone)、總皂苷(Astragalus saponin)及總多糖(Astragalus polysaccharide)對睪丸Leydig細(xì)胞具有保護(hù)作用[6-9]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)對大鼠睪丸Leydig細(xì)胞中雌、雄激素分泌均有明顯抑制作用[10]。本實驗探討在黃芪中哪種成分對損傷睪丸Leydig細(xì)胞合成雌二醇(estradiol,E2)作用效果最佳。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

大鼠睪丸Leydig細(xì)胞系(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)；胎牛血清(上海翊圣生物科技有限公司)；胰蛋白酶(YEASEN公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)；TGF-β1細(xì)胞因子(Peprotech公司)；大鼠雌二醇(estradiol，E2)ELISA試劑盒、大鼠細(xì)胞色素P450芳香化酶(P450arom)ELISA試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司)；黃芪總黃酮、黃芪總皂苷、黃芪總多糖(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Leydig細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：用RPMI1640完全培養(yǎng)基(90% RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10%胎牛血清)，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)睪丸Leydig細(xì)胞。將細(xì)胞分對照組、模型組(5 ng/mL TGF-β1造模)和中藥干預(yù)組。根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]和預(yù)實驗的結(jié)果，將中藥干預(yù)組分為：低和高劑量黃芪總黃酮組(終濃度為10和50 mg/L)；低和高劑量黃芪總皂苷組(終濃度為20和100 mg/L)；低和高劑量黃芪總多糖組(終濃度為10和100 mg/L)。

1.2.2 細(xì)胞爬片：用血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，然后按照5×104個/mL的濃度稀釋細(xì)胞，在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中預(yù)先放置好無菌的蓋玻片，將稀釋好的細(xì)胞按每孔2 mL接種到6孔板中。

1.2.3 ELISA檢測E2、P450arom及細(xì)胞爬片染色：每組細(xì)胞加藥48 h后取出細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書對E2、P450arom進(jìn)行檢測，細(xì)胞爬片用PBS洗滌2遍，多聚甲醛固定1/2 h，進(jìn)行HE染色，然后用顯微鏡觀察。

1.2.4 細(xì)胞的計數(shù)：將細(xì)胞放大200倍進(jìn)行觀察，每張細(xì)胞爬片隨機選取5個視野，用Imagej-win64軟件進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃芪主要成分對睪丸Leydig細(xì)胞合成E2、P450arom的影響

和正常組比較，模型組睪丸Leydig細(xì)胞中的E2含量降低26.14%, P450arom蛋白含量降低50.56%。和模型組比較，黃芪總黃酮(10和50 mg/L)、黃芪總皂苷(20和100 mg/L)、黃芪總多糖(10和50 mg/L)使睪丸Leydig細(xì)胞中的E2含量分別升高14.56%、19.77%、37.51%、13.61%、26.03%和1.54%，P450arom含量分別升高2.50%、27.56%、0.57%、10.74%、27.14%和24.23%(表1)。

表1 黃芪主要成分對睪丸Leydig細(xì)胞合成E2、P450arom的影響Table 1 Effects of different Atragalus compositions on E2 and P450arom composition in Leydig cells

2.2 HE染色觀察睪丸Leydig細(xì)胞形態(tài)

模型組較正常組細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞呈多種形態(tài)，以梭形、多角形細(xì)胞為主，核染色較深，核仁不清楚。中藥干預(yù)組細(xì)胞數(shù)量明顯多于模型組，但少于正常組，胞體呈圓形、多邊形、梭形、多角形,以圓形和多邊形細(xì)胞為主，部分可見核仁(圖1)。

2.3 黃芪主要成分對TGF-β1損傷睪丸Leydig細(xì)胞數(shù)量的影響

將TGF-β1作用于模型組Leydig細(xì)胞后，與模型組、實驗組細(xì)胞和正常組細(xì)胞相比形態(tài)異常，數(shù)量減少(P<0.01)。黃芪總黃酮、黃芪總皂苷、黃芪總多糖干預(yù)后，實驗組細(xì)胞病變改善明顯，和模型組相比，細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.01)(表2)。

3 討論

雄性動物的血清、睪丸網(wǎng)以及精液中都存在著一定濃度的雌激素。雌激素不僅對雌性生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，對雄性生殖系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能的維持也同樣起著非常重要的作用[11]。睪丸Leydig細(xì)胞占睪丸細(xì)胞總數(shù)的2%～4%，是睪丸中的內(nèi)分泌細(xì)胞。P450arom作用于睪丸Leydig細(xì)胞、支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞。成熟Leydig細(xì)胞中的P450arom在絨促性素誘導(dǎo)將合成的T轉(zhuǎn)化成E2[10]。當(dāng)Leydig細(xì)胞損傷或P450arom表達(dá)及活性降低時， Leydig細(xì)胞合成E2減少甚至不合成，精子的發(fā)生就會受到影響。

圖1 黃芪主要成分對各組細(xì)胞形態(tài)的影響Fig 1 Effects of different Astragalus compositions on cellular morphology in each group (HE，×200)

表2 黃芪主要成分對TGF-β1損傷睪丸Leydig細(xì)胞的影響Table 2 Effects of different Atragalus compositions on TGF-β1-induced Leydig cells numbers

臨床實踐和文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，黃芪及其主要成分對睪丸和Leydig細(xì)胞具有保護(hù)作用。黃芪總黃酮具有較強的抗輻射作用，能顯著提高受致死劑量60Co-γ射線照射小鼠的存活率，降低輻射對小鼠外周血WBC和PLT及脾臟的損傷作用[7]。黃芪多糖可能通過清除氧自由基及抗脂質(zhì)過氧化的機制，減輕大劑量射線對睪丸間質(zhì)細(xì)胞表面的損傷[7-8]。黃芪總皂苷能夠有效降低糖尿病大鼠空腹血糖，能提高身體質(zhì)量和睪丸指數(shù)，提高血清睪酮含量，改善睪丸組織生化指標(biāo)，改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷，改善睪丸組織病變和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，提示黃芪總皂苷對糖尿病大鼠睪丸組織具有保護(hù)作用[9，12]。

TGF-β1在人睪丸表達(dá)的研究表明：TGF-β1可表達(dá)于人睪丸的間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞與生精細(xì)胞。TGF-β1是一種間質(zhì)細(xì)胞的局部調(diào)節(jié)因子，通過自分泌和旁分泌方式，在睪丸的發(fā)育與成熟和精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用[13]。TGF-β1對大鼠睪丸Leydig細(xì)胞中雌、雄激素分泌均有明顯抑制作用[10]。

通過文獻(xiàn)檢索，尚未有黃芪主要成分對損傷睪丸Leydig細(xì)胞合成E2作用效果最佳成分的研究報道。本實驗采用TGF-β1對體外培養(yǎng)的睪丸Leydig細(xì)胞進(jìn)行模型構(gòu)建，以黃芪總黃酮、黃芪總皂苷和黃芪總多糖分別對TGF-β1損傷的睪丸Leydig細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。實驗發(fā)現(xiàn)，三者均能緩解TGF-β1抑制睪丸Leydig細(xì)胞分泌E2、P450arom的作用，終濃度20 mg/L黃芪總皂苷緩解TGF-β1抑制睪丸Leydig細(xì)胞合成E2的作用最明顯，終濃度50 mg/L的黃芪總黃酮緩解TGF-β1抑制睪丸Leydig合成P450arom的作用最明顯；三者均能改善睪丸Leydig細(xì)胞病變，促進(jìn)Leydig細(xì)胞的增殖，20 mg/L黃芪總皂苷促使TGF-β1誘導(dǎo)下Leydig細(xì)胞的增殖效果最顯著。