田苡簫，李 菁

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科 風(fēng)濕免疫病學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 北京 100032)

反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR)是目前分析基因表達(dá)水平的黃金標(biāo)準(zhǔn)，卻經(jīng)常表現(xiàn)出重復(fù)性欠佳的問題，選取合適的內(nèi)參基因有助于改善這一情況[1]。大動(dòng)脈炎(Takayasu arteritis，TAK)是以主動(dòng)脈及其一級分支受累為主，表現(xiàn)為非特異性慢性肉芽腫性血管炎的系統(tǒng)性疾病。糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑是治療TAK的常用藥物，這二者均可能導(dǎo)致TAK患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中管家基因表達(dá)水平的改變。在用相對定量qPCR分析TAK患者與健康對照(healthy control,HC)人群的基因表達(dá)差異時(shí)，合適的內(nèi)參基因有利于得到更穩(wěn)定、更準(zhǔn)確、組間差異更小的結(jié)果[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：人淋巴細(xì)胞分離液(深圳市達(dá)科為生物工程有限公司);Trizol Reagent(Ambion公司);TaKaRa RR047A、引物(蘇州金唯智生物科技有限公司，純化方式為PAGE-Plus);Easy dilution(TaKaRa 9160)、iTaqTMUniversal SYBR? Green Supermix(Bio-Rad公司)。

1.1.2 外周血樣本：2019年4月至2019年6月于北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診納入TAK患者18例，均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1990年的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，采用1994年NIH標(biāo)準(zhǔn)評估疾病活動(dòng)性[3]，納入健康對照9人。樣本的采集和使用經(jīng)過北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(S-478)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的分離、RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄：用無熱原的采血針和真空乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管(Becton Dickinson公司)采集肘部靜脈血，常溫放置，8 h內(nèi)用密度梯度離心法分離PBMC。用Trizol法從PBMC中提取總RNA，紫外分光光度法檢測RNA的濃度和純度，取A260/A280在1.8～2.1、瓊脂糖凝膠電泳可見28 S和18 S條帶清晰無彌散、28 S條帶亮度約為18 S條帶亮度2倍的樣本，除去基因組DNA(gDNA)之后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 內(nèi)參基因的選擇和引物的檢測：9個(gè)候選基因的相關(guān)信息見“2.3 引物的擴(kuò)增效率、線性范圍和特異性”。以Cq值為縱坐標(biāo)、以初始模板量的log值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸系數(shù)和擴(kuò)增效率[擴(kuò)增效率=(10-1/斜率-1)×100%]，確定線性范圍。

1.2.3 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析：用geNorm、NormFinder、BestKeeper 3種程序分別對各組[混合組(mixed group，TAK患者+健康對照)、健康對照組(healthy control，HC)、TAK組]候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行排序，對內(nèi)參基因進(jìn)行篩選。

1.2.4 分析結(jié)果的檢驗(yàn):以geNorm篩選出的mixed group的基因組合為內(nèi)參，計(jì)算各組(HC組、TAK組、活動(dòng)性TAK組、非活動(dòng)性TAK組)PBMC中候選內(nèi)參基因mRNA的相對含量，并比較組間差異。

以T-bet、GATA3和RORC為目的基因，分別以穩(wěn)定性不同的基因?yàn)閮?nèi)參，分析目的基因mRNA的組間差異，并與文獻(xiàn)報(bào)道作比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TAK患者的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)和臨床特征

TAK患者的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)和臨床特征見表 1。健康對照組(HC)納入9人(1名男性，8名女性)。

2.2 RNA樣本的純度與完整性

RNA樣本的A260/A280均在1.8～2.1，A230不低于1.7，瓊脂糖凝膠電泳可見電泳可見28 S、18 S條帶清晰無彌散，28 S條帶亮度約為18 S條帶亮度的2倍。

2.3 引物的擴(kuò)增效率、線性范圍和特異性

引物的序列、擴(kuò)增效率、線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線等信息見表2。融解曲線均為單峰。

2.4 基因表達(dá)的穩(wěn)定性分析

用geNorm[4]、NormFinder[5]、BestKeeper[6]這3種計(jì)算方法對9個(gè)基因的表達(dá)穩(wěn)定性的分析結(jié)果如所示。用geNorm分析時(shí)，混合組PBMC的各候選內(nèi)參基因的M值均小于1.5，穩(wěn)定性為GAPDH(0.419)

表1 入組TAK患者的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)和臨床特征Table 1 Laboratory parameters and clinical features of patients with M(Q1,Q3)]

表2 RT-qPCR引物相關(guān)信息Table 2 Details of the primers used for RT-qPCR

Pairwise variation (Vn/n+1) analysis was used to determine the optimal number of reference genes required for RT-qPCR normalization in different panels圖1 geNorm 計(jì)算的成對變異 Vn/n+1值Fig 1 Pairwise variation (Vn/n+1) calculated by geNorm

表3 按照geNorm、NormFinder或BestKeeper的計(jì)算結(jié)果對候選基因穩(wěn)定性排序Table 3 Reference genes were ranked in order of their stability calculated by geNorm, NormFinder or BestKeeper

A.histogram of the expression levels of 9 candidate reference genes in 4 panels, normalized to the geometric mean of Cq value of B2M and SDHA; B.intra-group variation and inter-group variation of candidate reference genes calculated by NormFinder; C.the relative expression levels of 3 target genes (T-bet, GATA3 and RORC) in 4 panels, respectively normalized to the geometric mean of Cq value of B2M and SDHA, HPRT1 and GAPDH；TAK.takayasu arteritis, n=18；control.healthy control, n=9;active TAK, n=10; nonactive TAK, n=8;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with control； #P<0.05, ##P<0.01 compared with nonactive TAK圖2 內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性對相對定量的影響Fig 2 Effect of stability of reference gene expression on relative quantification

分別以B2M-SDHA組合(geNorm所篩選)、HPRT1(NormFinder和BestKeeper所篩選)以及GAPDH(3種方法均顯示穩(wěn)定性略低的基因)為內(nèi)參，比較TAK組、對照組、活動(dòng)組、非活動(dòng)組的PBMC中T-bet、GATA3和RORC的mRNA含量(圖 2C)。

3 討論

當(dāng)采用相對定量qPCR進(jìn)行基因表達(dá)差異分析時(shí)，選擇合適的內(nèi)參基因有助于得出更穩(wěn)定、更準(zhǔn)確、組內(nèi)變異更小的結(jié)果。本研究中，以B2M-SDHA組合和HPRT1作為內(nèi)參基因時(shí)，各組間差異的趨勢幾乎一致，但是以B2M-SDHA組合作為內(nèi)參基因時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異且組內(nèi)差異更小；以GAPDH作為內(nèi)參基因時(shí)，分析結(jié)果與前二者差異較大，這可能是因?yàn)門AK組PBMC中GAPDH較HC組顯著上調(diào)。多項(xiàng)研究顯示，不同亞型的T細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)不同。糖皮質(zhì)激素促進(jìn)Th1細(xì)胞的凋亡、并抑制Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，但是Th2和Th17細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抗性[7]，這可能與Bcl-2[8]、P-糖蛋白[9]等因子的作用有關(guān)。綜上所述，以B2M-SDHA組合作為內(nèi)參基因測得的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道更為一致。

有些候選內(nèi)參基因的mRNA水平存在顯著的組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與疾病狀態(tài)或藥物治療有關(guān)。例如，GAPDH是糖酵解中發(fā)揮重要作用的酶，它催化3-磷酸甘油醛氧化脫氫和磷酸化，生成1, 3-二磷酸甘油酸，因此，當(dāng)細(xì)胞的糖代謝受到明顯影響時(shí)，GAPDH的表達(dá)水平可能會(huì)發(fā)生變化；同時(shí)，它還具有多種功能，如DNA修復(fù)[10]、膜融合和膜轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、催化微管聚合[11]，提示GAPDH可能受較多因素影響。此外，β-肌動(dòng)蛋白基因(β-actin，即ACTB)編碼細(xì)胞骨架蛋白，因此其表達(dá)水平與淋巴細(xì)胞增殖的活躍程度有關(guān)，這可能是TAK患者PBMC中ACTB較健康對照組上調(diào)的原因之一。此外，SDHA、RPL13A、B2M在活動(dòng)組與非活動(dòng)組之間存在較小的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示這三種基因編碼的蛋白質(zhì)可能與疾病活動(dòng)性或藥物治療關(guān)聯(lián)較小。

本項(xiàng)研究顯示，自身免疫病患者或接受免疫抑制藥物治療時(shí)，原本在健康人群中穩(wěn)定表達(dá)的基因可能會(huì)上調(diào)或下調(diào)，從而干擾相對定量的結(jié)果。因此，在自身免疫病研究中選擇內(nèi)參基因時(shí)，需要進(jìn)行篩選；同時(shí)選用初治和經(jīng)治患者為研究對象有助于確定可靠的內(nèi)參基因。