謝 飛，周美蘭

(1.武警陜西省總隊醫(yī)院 內(nèi)一科， 陜西 西安 710054； 2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腎臟內(nèi)科， 陜西 西安 710032)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者常見的合并癥之一，也是目前引起終末期腎病的重要原因[1]；足細(xì)胞是腎小球過濾屏障的重要組成部分，在維持腎小球濾過膜正常通透性方面發(fā)揮著重要作用，其損傷與DN發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而改善足細(xì)胞損傷可減緩或阻止DN發(fā)展[2]。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflower yellow A，HYSA)是從中藥紅花中提取的一種具有單查爾酮苷類結(jié)構(gòu)的化合物，是紅花黃色素的主要藥理活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化和抗感染等多種藥理活性[3]。研究[4]顯示，HYSA可通過減少高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和活性氧的生成等發(fā)揮保護(hù)糖尿病血管損傷的作用。有研究[5]指出，HYSA具有保護(hù)慢性腎病腎臟功能的作用，但其對DN的影響并不完全清楚。本研究通過觀察HYSA對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的影響及其機(jī)制，旨在揭示HYSA是否具有保護(hù)足細(xì)胞損傷的作用，為DN的治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞： 小鼠腎足細(xì)胞系MPC5(上海斯信生物公司)。

1.1.2 試劑及試劑盒： γ干擾素(Protech公司)；HSYA標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，上海源葉生物科技公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco公司)；BCA蛋白定量試劑盒和全蛋白提取試劑盒(北京索萊寶生物技術(shù)公司)；MDA、SOD和GSH-PX檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；Anexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；caspase-3活性檢測試劑盒(Cell Signal Technology公司)；Nephrin、α-SMA、fibronectin、JNK和p-JNK抗體(Santa Cruz Biotechnology公司);GAPDH、VEGF抗體(Abcam公司);辣根過氧化酶標(biāo)記的IgG二抗(北京中杉金橋生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)、分組與處理: 先在溫度為33 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，用含10 U/mL γ干擾素和10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠腎足細(xì)胞。待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時，轉(zhuǎn)入溫度為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下以無γ干擾素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 d左右，待分化成熟后進(jìn)行實驗。實驗分為對照組(control)、高糖組(HG)及低、中、高劑量干預(yù)組。Control組給予5 mmol/L葡萄糖；HG組給予30 mmol/L葡萄糖；低、中、高劑量干預(yù)組給與30 mmol/L葡萄糖和終濃度分別為0.5、1、2 mg/L的HYSA。另設(shè)置一個不含細(xì)胞的空白對照組。其中每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活力: 將對數(shù)增殖期的足細(xì)胞以每孔5×104個接種至96孔細(xì)胞板上后，置于37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)過夜。次日，根據(jù)1.2中的分組處理細(xì)胞；處理24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液；孵育2 h后，用酶標(biāo)儀檢測足細(xì)胞在450 nm處的吸光度值，并計算出各組細(xì)胞存活率。實驗重復(fù)3次。計算公式：細(xì)胞存活率(%)=(實驗組吸光度值-空白組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞測量術(shù)檢測細(xì)胞凋亡： 收集上述各組細(xì)胞，經(jīng)磷酸緩沖液洗滌2次后，以1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞懸液(濃度為109個/L)于離心管中，避光下加入annexin V和PI各5 μL，室溫反應(yīng)15 min后，流式細(xì)胞測量術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 比色法檢測細(xì)胞caspase-3活性:收集上述各組細(xì)胞，參照caspase-3活性檢測試劑盒說明書步驟檢測各組細(xì)胞caspase-3活性。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 檢測細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD和GSH-PX含量：收集上述各組細(xì)胞，經(jīng)磷酸緩沖液洗滌3次后，以勻漿器冰凍破碎，參照MDA、SOD和GSH-PX試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD和GSH-PX含量。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot檢測細(xì)胞中nephrin、fibronectin、α-SMA、JNK、p-JNK和VEGF蛋白表達(dá)水平: 參照全蛋白提取試劑盒說明書提取足細(xì)胞總蛋白后，用BCA法檢測總蛋白的濃度與純度。將蛋白樣品與上樣緩沖液等體積混勻后，置于沸水浴中煮沸5 min。將變性后的蛋白樣品行SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂奶粉封膜2 h后，以一抗(nephrin 1∶800、fibronectin 1∶800、α-SMA 1∶1 000、JNK 1∶1 000、p-JNK 1∶1 000、VEGF 1∶1 000和GAPDH 1∶1 000)工作液4 ℃孵育過液；次日，再以二抗工作液(1∶5 000)室溫孵育2 h后，暗室內(nèi)加入化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光。以GAPDH為內(nèi)參，采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析足細(xì)胞中nephrin、fibronectin、α-SMA、JNK、p-JNK和VEGF蛋白表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HYSA對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞存活率的影響

高糖組細(xì)胞存活率較對照組明顯降低(P<0.05)；與高糖組比較，0.5、1和2 mg/L HYSA能夠不同程度地升高足細(xì)胞存活率(P<0.05)，且HYSA濃度越高足細(xì)胞存活率越高(表1)。

表1 各組細(xì)胞存活率的比較Table 1 Comparison of cell survival rates in each group

2.2 HYSA對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，HG組細(xì)胞凋亡率和caspase-3活性明顯升高(P<0.05)；給予HYSA(0.5、1和2 mg/L)作用后高糖對足細(xì)胞凋亡和caspase-3活性的促進(jìn)作用明顯受到抑制(P<0.05)，且HYSA濃度越高，足細(xì)胞凋亡率和caspase-3活性越低(圖1,表2)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況Fig 1 Flow cytometry detected apoptosis of each group

表2 各組細(xì)胞凋亡率和caspase-3活性的比較Table 2 Comparison of cell apoptosis rate and caspase-3 activity in each

2.3 HYSA對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

與對照組比較，HG組細(xì)胞中nephrin蛋白表達(dá)水平明顯下降，而fibronectin和α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；給予0.5、1和2 mg/L HYSA作用后足細(xì)胞中nephrin蛋白表達(dá)水平逐漸升高，而fibronectin和α-SMA蛋白表達(dá)水平逐漸降低，且與HG組比較差異均明顯(P<0.05)(圖2)。

2.4 HYSA對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與對照組比較，HG組細(xì)胞中SOD和GSH-PX含量明顯降低，而MDA含量明顯升高(P<0.05)；與HG組比較，HYSA能夠不同程度地升高足細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-PX含量，降低足細(xì)胞內(nèi)MDA含量(P<0.05)，且呈濃度依賴性(圖3)。

2.5 HYSA對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中JNK磷酸化和VEGF蛋白表達(dá)水平的影響

與對照組比較，HG組細(xì)胞中JNK磷酸化水平及VEGF蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；與HG組比較，給予0.5、1和2 mg/L HYSA作用后足細(xì)胞中JNK磷酸化水平及VEGF蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with HG group圖2 各組細(xì)胞中nephrin、fibronectin和α-SMA蛋白表達(dá)水平的比較Fig 2 Comparison of nephrin, fibronectin and α-SMA protein expression levels in each

*P<0.05 compared with control group圖3 各組細(xì)胞SOD、MDA和GSH-PX含量的比較Fig 3 Comparison of SOD, MDA and GSH-PX contents in each

*P<0.05 compared with the control group；#P<0.05 compared with the HG group圖4 各組細(xì)胞中JNK磷酸化水平和VEGF蛋白表達(dá)水平的比較Fig 4 Comparison of JNK phosphorylation level and VEGF protein expression level in each

3 討論

高糖環(huán)境下，足細(xì)胞數(shù)量減少，上皮表型蛋白nephrin表達(dá)降低，而間質(zhì)表型蛋白fibronectin、α-SMA表達(dá)升高，足細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，足細(xì)胞骨架出現(xiàn)紊亂、重組，引起足細(xì)胞形態(tài)和功能失調(diào)[6]；另外，高糖還可引起足細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，加重足細(xì)胞損傷[7]。足細(xì)胞數(shù)量減少、轉(zhuǎn)分化和氧化應(yīng)激等是導(dǎo)致足細(xì)胞屏障功能減弱、促進(jìn)DN發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。因此，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷常被作為研究DN足細(xì)胞損傷的細(xì)胞模型[8]。本研究以高糖刺激后發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞存活率和nephrin蛋白表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞凋亡率、凋亡執(zhí)行因子caspase-3活性和fibronectin、α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯升高；同時，足細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-PX含量降低，而MDA含量升高。表明高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功。

HYSA是一種具有廣泛生物學(xué)活性的查耳酮類化合物，可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和氧化應(yīng)激等在肺、腦和心肌等組織中發(fā)揮保護(hù)作用[9-11]。HSYA還可通過調(diào)控JNK/c-Jun信號通路抑制高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕細(xì)胞凋亡，在糖尿病防治中具有潛在的應(yīng)用價值[12]。本研究發(fā)現(xiàn)HYSA作用后，足細(xì)胞活力、nephrin蛋白表達(dá)水平和SOD、GSH-PX含量呈濃度依賴性升高，而細(xì)胞凋亡率、caspase-3活性和fibronectin、α-SMA蛋白表達(dá)水平以及MDA含量呈濃度依賴性降低，高糖刺激引起的足細(xì)胞損傷明顯改善。表明HSYA可通過抑制足細(xì)胞凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和氧化應(yīng)激改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。這提示HSYA在DN防治中具有潛在的應(yīng)用價值。JNK信號通路在DN中異常活化，可通過影響足細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等參與DN的發(fā)生發(fā)展,抑制該通路的活化可減輕足細(xì)胞損傷，恢復(fù)足細(xì)胞功能[13]。VEGF是一種作用很強(qiáng)的促血管生長因子，其異常表達(dá)與DN足細(xì)胞氧化應(yīng)激及微血管病變密切相關(guān)[14]。HYSA具有抑制JNK信號通路和VEGF表達(dá)的作用[15]。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，HYSA可呈濃度依賴性降低高糖引起的JNK磷酸化和VEGF蛋白表達(dá)。提示HYSA改善足細(xì)胞損傷的作用機(jī)制可能與抑制JNK信號通路活化和VEGF表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，HYSA可通過抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和氧化應(yīng)激保護(hù)足細(xì)胞損傷，該作用可能是通過抑制JNK信號通路活化和VEGF表達(dá)來實現(xiàn)的。