羅勇為，鐘曉燕，姚滿芳，吳茜茜，唐林波，易琳捷，張平軍

(1廣東省科學(xué)院生物工程研究所，廣東廣州510316；2廣東省綠色制糖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510316；3廣西桂林銳德檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)有限公司，廣西桂林541004；4桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西桂林541200；5廣西糖業(yè)集團(tuán)有限公司，廣西南寧530022)

0 引言

甜葉菊提取物在國(guó)際市場(chǎng)上作為一種主要的天然甜味劑，廣泛應(yīng)用于食品、包裝食品、桌面甜味劑、飲料(包括能量飲料)、膳食補(bǔ)充劑、烘焙產(chǎn)品、奶制品等行業(yè)[1-3]。每年全球該產(chǎn)品的銷售額高達(dá)幾億美金，市場(chǎng)迅速增長(zhǎng)，而且將繼續(xù)保持強(qiáng)勁的增長(zhǎng)趨勢(shì)。隨著消費(fèi)者對(duì)飲料產(chǎn)品和食品的成分含量越來(lái)越關(guān)注，目前許多消費(fèi)者也開(kāi)始避免攝入人工及化學(xué)合成甜味劑，減糖仍然是制造商取勝的關(guān)鍵所在[4-5]。而天然來(lái)源的甜葉菊和接近零熱量的市場(chǎng)定位具有明顯的優(yōu)勢(shì)。2014年，世界衛(wèi)生組織建議人們將日常糖攝入量減半，以及公眾對(duì)一些合成甜味劑的“安全性能”表示擔(dān)憂，使天然來(lái)源甜味劑甜菊糖的需求不斷攀升。此外，甜葉菊提取物在軟飲料和果汁、冰淇淋以及其他各種產(chǎn)品中的應(yīng)用日益增加，這歸因于甜葉菊提取物的高甜度天然甜味劑特性。到2025年甜菊糖有望占全球甜味劑市場(chǎng)份額的 15%～20%。全球甜菊糖甜味劑市場(chǎng)依據(jù)類型分為液體、粉末和藥片形式。日益增長(zhǎng)的肥胖水平加上對(duì)糖尿病和心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)注促使消費(fèi)者做出更健康的選擇，這有利于創(chuàng)造市場(chǎng)對(duì)甜菊糖的需求。由于健康問(wèn)題，合成或人工甜味劑的天然替代品的需求日益增加，再加上植物來(lái)源甜味劑需求的增長(zhǎng)等因素，預(yù)計(jì)將在未來(lái)5～10年推動(dòng)甜菊糖市場(chǎng)的增長(zhǎng)[6-10]。

由于粉末甜菊糖的可用性強(qiáng)和使用方便，到2025年該市場(chǎng)份額有望占據(jù)整個(gè)甜菊糖市場(chǎng)的70%。目前，中國(guó)已成為全球最大的甜葉菊生產(chǎn)與出口國(guó)，從原料到成品如何更好地滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的質(zhì)量控制要求，是行業(yè)經(jīng)久不息的關(guān)注點(diǎn)。本文從工業(yè)生產(chǎn)以及便捷快速檢測(cè)的視角初步研究同時(shí)測(cè)定甜葉菊葉片及其提取物中甜菊糖總苷的方法，有助于提高甜葉菊提取物生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制水平和產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，促進(jìn)甜葉菊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

甜葉菊原料來(lái)源于黑龍江、新疆、甘肅的甜葉菊種植基地；甜葉菊提取物來(lái)源于桂林萊茵生物科技股份有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)品：甜菊苷(購(gòu)自美國(guó) ChromaDex，含量98.53%)、瑞鮑迪苷 A(購(gòu)自美國(guó) ChromaDex，含量98.85%)；其他7種糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷和甜菊雙糖苷(均購(gòu)自 ChromaDex)。無(wú)水甲醇，AR 500 mL/瓶，西隴化工股份有限公司；乙腈為色譜級(jí)；磷酸：AR 500 mL/瓶，西隴化工股份有限公司；水為Milli-Q超純水。

圖1 甜菊糖苷9個(gè)成分混合標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器

高效液相色譜儀(型號(hào)：1200，美國(guó)安捷倫公司)，配備在線真空脫氣機(jī)、四元低壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)及Chemstation色譜工作站；電子分析天平(型號(hào)：XS205du，感量：0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司)；小型高速離心機(jī)(型號(hào)：TGL-16B，上海安亭科學(xué)儀器廠)；超聲波清洗器(型號(hào)：SK-7200H，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

以十八烷基鍵合硅膠填充柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)或同類型柱；以乙腈-0.1%磷酸水(30∶70，V/V)為流動(dòng)相；柱溫40℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。理論板數(shù)按瑞鮑迪苷A峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品溶液的制備

2.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別稱取適量甜菊苷、瑞鮑迪苷 A、瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊雙糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，置于同一個(gè)容量瓶中，用30%乙腈水溶液完全溶解后定容，制成每1 mL約含0.04 mg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用于確定9種糖苷的相對(duì)保留時(shí)間。甜菊糖苷9個(gè)成分混合標(biāo)準(zhǔn)品圖譜如圖1所示。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別取瑞鮑迪苷 A和甜菊苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，加30%乙腈水溶液制成每1 mL含1.0 mg的溶液，即得瑞鮑迪苷A和甜菊苷混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其圖譜見(jiàn)圖2。

2.2.3 甜葉菊葉片樣品溶液的制備

圖2 瑞鮑迪苷A和甜菊苷混合標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

檢查甜葉菊原料是否添加甜葉菊?；蚱渌s質(zhì)，進(jìn)行以下操作。

2.2.3.1 若未含有添加甜葉菊?；蚱渌s質(zhì)

目測(cè)無(wú)明顯的雜質(zhì)則直接取約50 g原料打粉，用50 mL容量瓶稱取樣品約2000 mg，加入35～40 mL甲醇浸泡1 h，超聲提取30 min，冷卻至室溫，定容至刻度，搖勻，離心，過(guò)0.45 μm濾膜，續(xù)濾液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶，待測(cè)。

2.2.3.2 若含有添加甜葉菊?；蚱渌s質(zhì)

目測(cè)有?；蜉^多雜質(zhì)的樣品則需取約200 g按四分法分成4份，任取一份原料打粉過(guò)100目篩，分別對(duì)上、下部分取樣，按2.2.3.1步驟進(jìn)行樣品溶液的制備；計(jì)算上、下部分的加權(quán)含量。過(guò)篩部分應(yīng)超過(guò)總打粉量的80%。

2.2.4 甜葉菊提取物樣品溶液的制備

取本品粉末約25 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加30%乙腈水溶液超聲處理，冷卻至室溫，30%乙腈水溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得樣品溶液。其中，甜葉菊原料樣品圖譜和甜葉菊提取物樣品圖譜見(jiàn)表3、表4。

圖3 甜葉菊原料樣品圖譜

2.3.5 測(cè)定法

分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品溶液各 10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。分別對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液進(jìn)行色譜分析。將樣品溶液的色譜圖與混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖相比較，以確定樣品溶液色譜圖中各組分對(duì)應(yīng)的峰。記錄樣品溶液色譜圖中甜菊苷、瑞鮑迪苷A、瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷 F、杜克苷 A、甜茶苷、甜菊雙糖苷的峰面積及標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖中甜菊苷和瑞鮑迪苷 A的峰面積。

瑞鮑迪苷A含量(以干基計(jì))的質(zhì)量分?jǐn)?shù)wa按公式⑴計(jì)算：

式中：mR-瑞鮑迪苷 A標(biāo)準(zhǔn)溶液中瑞鮑迪苷 A的質(zhì)量(以干基計(jì))，單位為毫克(mg)；m-樣品溶液中樣品的質(zhì)量(以干基計(jì))，單位為毫克(mg)；Aa-樣品溶液色譜圖中瑞鮑迪苷A的峰面積值；AR-瑞鮑迪苷A標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中瑞鮑迪苷A的峰面積值。

圖4 甜葉菊提取物樣品圖譜

其他8種糖苷含量(以干基計(jì))的質(zhì)量分?jǐn)?shù)wi按公式⑵計(jì)算：

式中：i-s、b、c、d、f、da、ru、sb，分別對(duì)應(yīng)甜菊苷、瑞鮑迪苷 B、瑞鮑迪苷 C、瑞鮑迪苷 D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊雙糖苷；mS-甜菊苷標(biāo)準(zhǔn)溶液中甜菊苷的質(zhì)量(以干基計(jì))，單位為毫克(mg)；m-樣品溶液中樣品的質(zhì)量(以干基計(jì))，單位為毫克(mg)；fi-i組分與甜菊苷的式量比值：1.00(甜菊苷)、1.00(瑞鮑迪苷 B)、1.18(瑞鮑迪苷 C)、1.40(瑞鮑迪苷 D)、1.16(瑞鮑迪苷 F)、0.98(杜克苷A)、0.80(甜茶苷)、0.80(甜菊雙糖苷)；Ai-樣品溶液色譜圖中i組分的峰面積值；AS-甜菊苷標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中甜菊苷的峰面積值。

由上述公式⑴和⑵計(jì)算得到 9種組分的含量wa、ws、wb、wc、wd、wf、wda、wru和wsb，取各組分含量之和即為樣品中甜菊糖苷含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性試驗(yàn)

取甜葉菊瑞鮑迪苷A溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針；①重復(fù)性：6次測(cè)試值的峰面積及保留時(shí)間的RSD值，以瑞鮑迪苷A計(jì)，峰面積的RSD值應(yīng)不高于1.0%，保留時(shí)間的RSD值應(yīng)不高于2.0%；②以瑞鮑迪苷A對(duì)稱因子計(jì)，應(yīng)在0.8～1.5之間；③分離度應(yīng)不低于 1.5；④理論塔板數(shù)，以瑞鮑迪苷 A理論塔板數(shù)計(jì)，應(yīng)不低于3000。結(jié)果如表1、表2所示。

結(jié)果表明：瑞鮑迪苷A的保留時(shí)間為11.5 min左右，峰面積的RSD 0.082%，遠(yuǎn)低于1.0%，保留時(shí)間的RSD 0.35%，低于2.0%，重復(fù)性良好；瑞鮑迪苷A對(duì)稱因子1.13，在0.8～1.5之間；瑞鮑迪苷A的分離度1.86，高于1.5，主成分與相鄰雜質(zhì)峰分離良好；瑞鮑迪苷 A理論塔板數(shù) 13803，遠(yuǎn)高于3000，柱效較高；整體表明檢測(cè)方法采用的色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性良好。

3.2 線性分析

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表2 色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

瑞鮑迪苷A、甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液曲線的制備：精密稱取瑞鮑迪苷A 49.43 mg，甜菊糖苷50.23 mg，分別置于25 mL容量瓶中，加入乙腈水溶液超聲溶解，放置至室溫，乙腈水定容至刻度，搖勻后做儲(chǔ)備液使用。用移液管移取適量，乙腈水定容至刻度，依次逐級(jí)稀釋制備其他5個(gè)不同濃度的溶液，將以上制備好的6個(gè)不同的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10 μL分別注入HPLC儀，制備瑞鮑迪苷A、甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線。結(jié)果如表3、表4所示。

結(jié)果表明：瑞鮑迪苷 A線性回歸方程：Y=1943.9444X+1.4026，相關(guān)系數(shù)R2=0.999994；甜菊糖苷線性回歸方程：Y=2330.3740X+3.7848，相關(guān)系數(shù)R2=0.999990；在0.001～2.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)與瑞鮑迪苷A、甜菊糖苷峰面積呈良好線性關(guān)系。

3.3 穩(wěn)定性分析

取甜葉菊提取物溶液，間隔一定時(shí)間進(jìn)樣1次，記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)表5。

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同時(shí)間同一甜葉菊提取物溶液進(jìn)樣，瑞鮑迪苷 A峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.12%，甜菊糖苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.18%，均小于2%，甜葉菊樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 甜葉菊瑞鮑迪苷A曲線的制備

表4 甜葉菊甜菊糖苷曲線的制備

表5 甜葉菊提取物溶液穩(wěn)定性考察

3.4 準(zhǔn)確度驗(yàn)證

精密稱取甜葉菊提取物9份，以3份為一個(gè)濃度，分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液為甜葉菊提取物中瑞鮑迪苷A、甜菊糖苷含量的40%、90%、130%，再加入30%乙腈水超聲溶解，冷卻至室溫，30%乙腈水定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)行HPLC分析，回收率結(jié)果見(jiàn)表6、表7。

結(jié)果表明，瑞鮑迪苷A加樣回收的平均回收率為100.32%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.47%；甜菊糖苷加樣回收的平均回收率為99.66%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.47%；回收率結(jié)果均在95%～105%之間，方法有良好的準(zhǔn)確度。

3.5 耐用性分析

精密稱取甜葉菊提取物24.88 mg，置于25 mL容量瓶中，加入30%乙腈水超聲溶解，冷卻至室溫，30%乙腈水定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)行HPLC分析。取不同品牌的色譜柱、更改色譜柱的溫度、更改流動(dòng)相流速分別進(jìn)行樣品含量的測(cè)定，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表8。

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用不同品牌的色譜柱，瑞鮑迪苷A含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.32%，甜菊糖苷峰含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.85%；更改色譜柱的溫度，瑞鮑迪苷A含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.19%，甜菊糖苷峰含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.36%；改變流動(dòng)相的流速，瑞鮑迪苷A含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21%，甜菊糖苷峰含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.28%；上述含量RSD均小于2%，說(shuō)明本檢測(cè)方法在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響，具有較好的耐用性。由試驗(yàn)可知，當(dāng)采用綠百草-C18，1.0 mL/min的流速，色譜柱溫度40℃時(shí)目標(biāo)峰峰型尖銳，主成分與相鄰雜質(zhì)峰分離良好，柱效較高，條件最優(yōu)。

表6 甜葉菊瑞鮑迪苷A回收率試驗(yàn)結(jié)果

表7 甜葉菊甜菊糖苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

表8 耐用性試驗(yàn)結(jié)果匯總

3.6 甜葉菊原料雜質(zhì)的影響

基于行業(yè)現(xiàn)狀，市場(chǎng)上銷售的甜葉菊原料大多含有不同程度的小石子、土、甜葉菊梗莖等雜質(zhì)，為了避免因含雜質(zhì)太高原料品質(zhì)變差而導(dǎo)致需要改進(jìn)工藝，從而提高生產(chǎn)成本，業(yè)內(nèi)提出雙12%標(biāo)準(zhǔn)：雜質(zhì)占比不超過(guò)12%，原料總苷含量不低于12%。為了提高檢測(cè)甜葉菊原料的效率并避免雜質(zhì)對(duì)結(jié)果的影響，取不含雜質(zhì)的甜葉菊加入不同的雜質(zhì)量進(jìn)行測(cè)試。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9。

結(jié)果表明，不同的雜質(zhì)添加量與過(guò)篩部分含量呈正相關(guān)，當(dāng)過(guò)100目篩部占總打粉重量的80%時(shí)，較為接近業(yè)內(nèi)的雙12%標(biāo)準(zhǔn)。所以過(guò)100目篩部分的甜葉菊原料應(yīng)超過(guò)總打粉重量的 80%；同時(shí)，對(duì)于雜質(zhì)較多的樣品，為了消除雜質(zhì)對(duì)甜葉菊含量的干擾，可通過(guò)對(duì) 100目篩上(通過(guò) 100目篩樣品)、篩下(未通過(guò) 100目篩樣品)部分的樣品粉末分別檢測(cè)，計(jì)算加權(quán)含量。

4 討論與結(jié)論

表9 甜葉菊原料中雜質(zhì)與過(guò)篩部分總苷的關(guān)系

本方法采用甜葉菊原料打粉過(guò)100目篩部分的 應(yīng)超過(guò)總打粉重量的 80%，通過(guò)計(jì)算上、下部分的加權(quán)含量能確保消除雜質(zhì)對(duì)原料的干擾，大大縮短甜葉菊原料的制樣時(shí)間的同時(shí)保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。色譜條件選擇綠百草-C18，乙腈：0.1%磷酸水洗脫，流動(dòng)相無(wú)需使用緩沖鹽體系，任一實(shí)驗(yàn)室均簡(jiǎn)便易配且能延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，有著良好的分離度和較高的柱效，色譜柱的分離度和使用壽命優(yōu)于甜菊糖苷國(guó)標(biāo)方法和文獻(xiàn)所述氨基柱方法[11]。加樣回收的瑞鮑迪苷 A和甜菊苷的平均回收率分別為99.66%、100.32%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.47%，滿足食品理化檢測(cè)中檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求中關(guān)于回收率參考范圍95%～105%的規(guī)定，表明該法有良好的準(zhǔn)確度，符合方法驗(yàn)證要求。校準(zhǔn)曲線濃度范圍覆蓋3個(gè)數(shù)量級(jí)，相關(guān)系數(shù)不低于 0.99，表明該法具有較好的線性范圍，符合方法驗(yàn)證要求。本方法的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，滿足方法驗(yàn)證的要求。本方法在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響，具有較好的耐用性。本方法目標(biāo)峰能與相鄰的雜質(zhì)有效分離，分離度及純度因子滿足要求，具有良好的專屬性。

甜菊糖苷RP-HPLC分析方法的驗(yàn)證結(jié)果表明，該分析方法有良好的精密度和較高的準(zhǔn)確度，線性范圍符合要求，能夠準(zhǔn)確、快速、有效地檢測(cè)出甜葉菊葉片及提取物中甜菊糖總苷的含量，控制各環(huán)節(jié)產(chǎn)品的質(zhì)量。