程孟祺，胡佳奇,2，趙雨薇,2，鄭紅剛，花寶金

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院, 北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué), 北京 100029)

食管癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，據(jù)2015年腫瘤登記數(shù)據(jù)顯示[1]，我國每年新發(fā)食管癌24.6萬例，死亡18.8萬例，位居腫瘤死亡原因第4位。食管癌起病隱匿，早期主要表現(xiàn)為吞咽不暢感或胸骨后疼痛，待吞咽梗阻明顯時多已進(jìn)入中晚期，預(yù)后較差。在食管癌的治療上，除了手術(shù)、放化療等方法，中醫(yī)藥亦發(fā)揮了重要作用[2]，可有效改善患者癥狀、緩解放化療不良反應(yīng)、延長患者生存期。食管癌屬中醫(yī)學(xué)“噎膈”范疇，其病機(jī)多屬虛實夾雜，以正氣虧虛為本，氣滯、痰阻、血瘀為標(biāo)，治療上注重權(quán)衡標(biāo)本虛實，靈活選用理氣化痰、消瘀散結(jié)之品[3]。威靈仙，性味辛、咸、溫，歸膀胱經(jīng)，是治療風(fēng)濕痹痛，肢體拘攣，諸骨鯁喉的常用藥，但亦常用于噎膈等癥的治療，正如《本草正義》所言：“威靈仙以走竄消克為能事，積濕停痰、血凝氣滯，諸實宜之”。急性子，是鳳仙花科植物鳳仙花的干燥成熟種子，具有破血、軟堅、消積之功?！侗静菥V目》言其主治“產(chǎn)難，積塊，噎膈，下骨鯁，透骨通竅”。威靈仙、急性子二藥均是中醫(yī)臨床治療食管癌的高頻用藥[4]，二者常相須為用，可增強(qiáng)化痰活血、軟堅散結(jié)之力，但兩藥配伍治療食管癌的藥效機(jī)制尚不明了，有待進(jìn)一步闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門從“多成分、多靶點、多途徑”的系統(tǒng)層面揭示藥物對機(jī)體調(diào)控作用的新興學(xué)科，在推進(jìn)中藥現(xiàn)代化研究方面發(fā)揮了重要作用[5]。因此，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對威靈仙-急性子藥對治療食管癌的活性成分、關(guān)鍵靶點、作用機(jī)制等進(jìn)行初步探索，為后續(xù)研究提供依據(jù)與思路。

1 資料與方法

1.1 收集篩選威靈仙-急性子活性成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫[6](http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集威靈仙、急性子的化學(xué)成分，按口服利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18進(jìn)行篩選。同時，根據(jù)2015年版《中國藥典》[7]中的藥物含量測定項對成分進(jìn)行補(bǔ)充，這部分活性成分雖不滿足上述篩選標(biāo)準(zhǔn)，但在藥材中含量較高，故亦納入。

1.2 預(yù)測威靈仙-急性子活性成分潛在靶點

通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)收集威靈仙、急性子各活性成分對應(yīng)的SDF格式的2D化學(xué)結(jié)構(gòu)，并上傳到Swiss Target Prediction平臺[8](http://www.swisstargetprediction.ch/)，設(shè)置物種為人類，預(yù)測出威靈仙-急性子活性成分潛在靶點。

1.3 收集食管癌疾病靶點

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)和DisGeNet數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)收集食管癌(esophageal cancer)的相關(guān)靶點。在Genecards數(shù)據(jù)庫中，Relevance score值越大則代表該靶點與疾病聯(lián)系越密切，若靶點過多，參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]，選擇篩選Relevance Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點為食管癌的潛在靶點。將以上3個數(shù)據(jù)庫的靶點合并，刪除重復(fù)值得到食管癌的潛在靶點。

1.4 獲取藥物與疾病的共同靶點

借助Venny 2.1 ( https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)將藥物活性成分與疾病作用靶點取交集，獲得威靈仙-急性子藥對治療食管癌的關(guān)鍵靶點，繪制韋恩圖。

1.5 構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)

為作圖方便，將威靈仙、急性子以拼音首字母標(biāo)記，各活性成分以拼音首字母加數(shù)字標(biāo)記，二藥共有成分以大寫英文字母進(jìn)行標(biāo)記。在Cytoscape3.7.2中構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.6 構(gòu)建關(guān)鍵靶點蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)

將1.4得到的關(guān)鍵靶點上傳至String平臺[10](Version 11.0, https://string-db.org/)，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，置信度>0.9，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，設(shè)置節(jié)點大小、顏色以反映連接度值(Degree)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)Degree篩選核心靶點。

1.7 GO功能、KEGG通路富集分析

在Metascape在線平臺[11](http://metascape.org/)上傳關(guān)鍵靶點，設(shè)置P<0.01，進(jìn)行GO分析[由細(xì)胞組成(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)、生物過程(biological process, BP)3部分組成]和KEGG分析，按P值升序排列，各選擇前20條分析結(jié)果，通過OmicShare網(wǎng)站(https://www.omicshare.com/)分別繪制高級氣泡圖。

1.8 構(gòu)建“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)

在Cytoscape3.7.2中導(dǎo)入威靈仙-急性子藥對活性成分、前20條KEGG富集通路及對應(yīng)的關(guān)鍵靶點，繪制“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分及靶點篩選

以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為條件，在TCMSP數(shù)據(jù)庫收集篩選威靈仙-急性子的活性成分，并結(jié)合2015版中國藥典進(jìn)行補(bǔ)充，其中威靈仙補(bǔ)充活性成分齊墩果酸，急性子補(bǔ)充鳳仙萜四醇皂苷A、鳳仙萜四醇皂苷K。研究共納入威靈仙活性成分8種，急性子11種，其中共有成分2種，故最終納入威靈仙-急性子藥對活性成分17種，成分信息見表1。將Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到的靶點去重后，獲得威靈仙活性成分作用靶點119個，急性子348個，合并去重處理后，得到威靈仙-急性子藥對活性成分潛在作用靶點379個。

表1 威靈仙-急性子藥對主要活性成分

2.2 食管癌靶點的獲取及藥物與疾病交集靶點的獲取

在Genecards數(shù)據(jù)庫中搜集食管癌靶點7 056個，考慮靶點基因過多，按Relevance Score分?jǐn)?shù)由高到低進(jìn)行排序，經(jīng)兩次篩選大于中位數(shù)的靶點后，獲得1 766個靶點。結(jié)合Disgenet、TTD數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充食管癌靶點，合并去重，共獲得疾病靶點2 396個。在Venny2.1.0中將篩選出的威靈仙-急性子活性成分靶點與食管癌靶點取交集，得到178個共同關(guān)鍵靶點，見圖1。

圖1 威靈仙-急性子活性成分與食管癌靶點的韋恩圖Fig 1 Venn diagram of active components of Radix Clematidis - Impatientis Semen and targets of esophageal cancer

2.3 “藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)的建立

運(yùn)用Cytoscape3.7.2構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。本網(wǎng)絡(luò)由198個節(jié)點和638條邊構(gòu)成，節(jié)點對應(yīng)的標(biāo)記見表1。采用Cytoscape軟件內(nèi)置的Network Analyzer工具計算節(jié)點的度值(Degree)大小。節(jié)點度值越大，說明在在網(wǎng)絡(luò)中越重要。其中槲皮素(Degree=65)、山柰酚(Degree=63)、花生四烯酸甲酯(Degree=53)、3-表齊墩果酸(Degree=43)、齊墩果酸(Degree=42)，位居前5位。

圖2 “藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Network diagram of “drug-active components-disease-target”

2.4 威靈仙-急性子藥對治療食管癌的關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

在String 11.0平臺上傳178個關(guān)鍵靶點，將置信度高于0.9的數(shù)據(jù)導(dǎo)入至Cytoscape3.7.2，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)由144個節(jié)點和661條邊構(gòu)成，節(jié)點越大，顏色越深，連線越密集，則地位越重要。節(jié)點度值前5的靶點為PIK3CA、PIK3R1、SRC、MAPK1、MAPK3，分別對應(yīng)48、44、42、37、34，提示這些靶點可能是威靈仙-急性子藥對治療食管癌的核心靶點。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network diagram

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

通過Metascape在線平臺對威靈仙-急性子藥對活性成分治療食管癌的關(guān)鍵靶點進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，共有2 304個GO術(shù)語條目，其中細(xì)胞組成116個，分子功能187個，生物過程2 001個，KEGG富集顯示143條通路。按P值排序后，取前20條通過Omicshare平臺轉(zhuǎn)化為高級氣泡圖，見圖4～7。

圖4 威靈仙-急性子藥對治療食管癌關(guān)鍵靶點的GO CC分析Fig 4 GO CC analysis of Radix Clematidis - Impatientis Semen on key targets for the treatment of esophageal cancer

圖5 威靈仙-急性子藥對治療食管癌關(guān)鍵靶點的GO MF分析Fig 5 GO MF analysis of Radix Clematidis - Impatientis Semen on key targets for the treatment of esophageal cancer

圖6 威靈仙-急性子藥對治療食管癌關(guān)鍵靶點的GO BP分析Fig 6 GO BP analysis of Radix Clematidis - Impatientis Semen on key targets for the treatment of esophageal cancer

圖7 威靈仙-急性子藥對治療食管癌關(guān)鍵靶點的KEGG通路富集分析Fig 7 KEGG pathway enrichment analysis of Radix Clematidis - Impatientis Semen on key targets for the treatment of esophageal cancer

GO功能富集分析結(jié)果顯示，細(xì)胞組成主要集中于受體復(fù)合物(receptor complex)、膜筏(membrane raft)、膜微域(membrane microdomain)等部位，見圖4；分子功能主要集中于蛋白激酶活性(protein kinase activity)、以醇基為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性(phosphotransferase activity, alcohol group as acceptor)、激酶活性(kinase activity)等方面，見圖5；生物過程主要集中于絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of MAPK cascade)、轉(zhuǎn)移酶活性的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of transferase activity)、激酶活性的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of kinase activity)等方面，見圖6。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，癌癥通路(Pathways in cancer)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌癥中心碳代謝(Central carbon metabolism in cancer)、癌癥蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)等20條通路與威靈仙-急性子治療食管癌可能相關(guān)，見圖7。根據(jù)以上KEGG通路富集結(jié)果，并結(jié)合文獻(xiàn)查閱，篩選出與食管癌相關(guān)的通路，涉及PI3K-Akt、Rap1、Ras、VEGF等信號通路。

2.6 “活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

將威靈仙-急性子藥對活性成分、前20條KEGG富集通路及對應(yīng)的關(guān)鍵靶點導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，繪制“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，其中綠色V形節(jié)點代表通路，圓形節(jié)點代表藥物活性成分，藍(lán)色方形節(jié)點代表關(guān)鍵靶點，見圖8，對應(yīng)標(biāo)記見表1。該網(wǎng)絡(luò)圖反映出威靈仙-急性子藥對治療食管癌“多成分、多靶點、多通路”的調(diào)控特點。

圖8 “活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 8 Network diagram of “active component-target-pathway”

3 討論

研究表明，食管癌最常見的兩個中醫(yī)證型是氣滯血瘀證及痰瘀互結(jié)證[12]。威靈仙、急性子作為理氣化痰、消瘀散結(jié)的經(jīng)典組合，是治療食管癌的常用藥對[13]，對控制腫瘤進(jìn)展、緩解噎膈癥狀具有重要意義。根據(jù)藥理研究結(jié)果，威靈仙提取物對舌鱗癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞等的生長均具有抑制作用[14, 15]。急性子包含脂肪油、黃酮、萘醌類、皂苷類等多種化學(xué)成分，其提取物對肺癌、乳腺癌等癌細(xì)胞的增殖有不同程度的抑制作用[16]。但目前尚缺乏威靈仙、急性子治療食管癌的相關(guān)實驗研究，故在此運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行初步探討。

本研究共篩選出威靈仙-急性子藥對活性成分17個，關(guān)鍵靶點178個。經(jīng)“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)分析可知，槲皮素、山柰酚、花生四烯酸甲酯、3-表齊墩果酸、齊墩果酸可能是威靈仙-急性子藥對治療食管癌的關(guān)鍵活性成分。既往基礎(chǔ)研究表明[17-20]，槲皮素可以抑制人食管癌Eca-109細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及血管新生，促進(jìn)凋亡，誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬以加強(qiáng)抗增殖作用，并可通過抑制NF-κB增強(qiáng)化療療效。山柰酚屬于黃酮類化合物，李瑞君等[21]研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚能夠抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖，并可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。3-表齊墩果酸、齊墩果酸均屬五環(huán)三萜類化合物，可調(diào)控多條信號通路抑制腫瘤的進(jìn)展[22]。有研究表明[23, 24]，齊墩果酸等三萜類化合物在一定濃度范圍內(nèi)能明顯抑制食管癌細(xì)胞的增殖，并且增強(qiáng)5-氟尿嘧啶等化療藥物抗食管癌的療效。對于花生四烯酸甲酯，目前暫無相關(guān)實驗研究，可能是威靈仙-急性子藥對治療食管癌的又一發(fā)現(xiàn)，有待進(jìn)一步驗證。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)可知，威靈仙-急性子藥對的活性成分主要通過作用于PIK3CA、PIK3R1、SRC、MAPK1、MAPK3等核心靶點發(fā)揮作用。PIK3CA基因和PIK3R1基因分別編碼組成PI3K蛋白(磷脂酰肌醇3-激酶)的p110催化亞基和p85調(diào)節(jié)亞基，故兩者的突變或激活均可以激活PI3K蛋白，引起PI3K-Akt信號通路活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[25]。有研究表明[26]，PI3K3CA可促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移，抑制其凋亡。SRC基因編碼非受體酪氨酸激酶，在包括食管癌的多種腫瘤中都呈現(xiàn)過表達(dá)或持續(xù)激活狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[27, 28]。MAPK1又稱ERK2，編碼細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2，MAPK3又稱ERK1，編碼細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1，兩者是ERK信號通路的重要組件，其過度激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥的形成關(guān)系密切[29]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[30, 31]，磷酸化的ERK1/ERK2能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與調(diào)控癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及血管擬態(tài)形成有關(guān)。

通過KEGG通路富集分析及相關(guān)文獻(xiàn)查閱可知，威靈仙-急性子藥對治療食管癌主要涉及PI3K-Akt、Rap1、Ras、VEGF等信號通路。PI3K-Akt信號通路是最常見的腫瘤信號通路之一，該通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥密切相關(guān)[32]，在食管癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等方面發(fā)揮著重要作用[33]，有研究表明[34]，其能夠促進(jìn)食管癌組織微淋巴管的生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Rap1信號通路可調(diào)控細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞極性形成、血管生成等多種細(xì)胞活動，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系[35]。Rap1通路通過多種方式介導(dǎo)細(xì)胞外張力增加的影響，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長[36]。Rap1b是Rap1的一種亞型，在食管鱗癌中表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[37]。調(diào)查研究顯示，Ras基因突變大約存在于30%的癌癥患者體內(nèi)，Ras通路是參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的重要通路，在食管癌的發(fā)病過程中扮演重要角色[38-40]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通路是促進(jìn)腫瘤血管新生作用最強(qiáng)的調(diào)控通路之一[41]，而實體腫瘤的進(jìn)一步生長、浸潤及轉(zhuǎn)移都離不開新生血管的形成，VEGF在食管癌組織中高表達(dá)，與食管癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等密切相關(guān)[42]，抑制VEGF的過表達(dá)，阻斷VEGF通路，是治療的關(guān)鍵。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，本研究發(fā)現(xiàn)威靈仙-急性子藥對中的槲皮素、山柰酚、3-表齊墩果酸、齊墩果酸等主要活性成分可能通過PI3K-Akt、Rap1、Ras、VEGF等信號通路作用于PIK3CA、PIK3R1、SRC、MAPK1、MAPK3等食管癌核心靶點，發(fā)揮了抗腫瘤增殖、促腫瘤凋亡、抑制新生血管生成、預(yù)防淋巴轉(zhuǎn)移等作用，體現(xiàn)了中藥“多成分、多途徑、多靶點”的調(diào)控特點，為后續(xù)實驗研究提供了依據(jù)與思路，有待進(jìn)一步的科學(xué)驗證。