朱 慧， 李嘉文， 繩秀珍**， 唐小千， 邢 婧， 戰(zhàn)文斌, 2

(1. 中國海洋大學水產動物病害與免疫學實驗室，山東 青島 266003;2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室，海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266237)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)隸屬于弧菌屬(Vibrio)，是一種致病性革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛分布于海水和海洋環(huán)境中，可引起海水養(yǎng)殖魚類、貝類及甲殼類等經濟動物流行病并導致暴發(fā)性死亡，已成為海水養(yǎng)殖動物的主要病原菌之一，給海水養(yǎng)殖產業(yè)造成嚴重的經濟損失[1-3]。海產品中的副溶血弧菌也是常見的引起食物中毒或食源性疾病的重要病原菌[4-6]。副溶血弧菌的快速檢測是預防和控制該病原菌傳播及食源性中毒或疾病發(fā)生的關鍵。

目前，已見報道的副溶血弧菌檢測方法主要有檢測病原核酸的環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)、聚合酶鏈式反應(PCR)、實時定量PCR等[7-10]，這些技術各有優(yōu)勢，但在實用性上有一定的局限，耗時長，操作復雜，需要專業(yè)設備，基層的普通養(yǎng)殖人員難以完成檢測操作。近年來發(fā)展起來的重組酶聚合酶擴增(RPA)技術被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術，有學者建立了副溶血弧菌Real-time RPA技術[11]，該技術檢測時間短，但是需要提取檢測病原的核酸，仍然不能滿足現(xiàn)場使用的需求。副溶血弧菌免疫學檢測技術已有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫熒光抗體技術[12-13]，也需要操作經驗和專業(yè)儀器設備。膠體金免疫層析試紙具有易于攜帶、檢測時間短、操作簡便、結果肉眼可見、不需要專業(yè)設備、適用于現(xiàn)場等優(yōu)點，是一種十分有發(fā)展前景的現(xiàn)場快速檢測技術，已在醫(yī)學檢驗中得到廣泛應用，但是，水產動物病原的現(xiàn)場快速檢測試紙尚未得到很好地開發(fā)，關于副溶血弧菌膠體金快速檢測試紙的資料較少[14]。

細菌是多種抗原成分組成的復合體，不同病原菌之間可能存在的共同抗原蛋白會導致交叉免疫反應性，因此，排除交叉反應對檢測結果判定的干擾是免疫學技術檢測病原時需要解決的關鍵問題。我們前期曾制備了魚類病原性溶藻弧菌快速檢測試紙[15]，能夠準確鑒別溶藻弧菌感染及其與其他菌的交叉反應。為了滿足副溶血弧菌快速檢測的需求，本文制備了兔抗副溶血弧菌多克隆抗體，標記20 nm膠體金后制得金標墊，提取副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌蛋白，將不同濃度的4種抗原蛋白作為4條檢測線，特別在T4線設置全菌蛋白，以羊抗兔IgG作為質控線，基于競爭免疫層析技術制備了副溶血弧菌膠體金快速檢測試紙，對患病牙鲆組織的檢測結果顯示其能夠準確鑒別副溶血弧菌感染。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與動物

實驗所用副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、魚腸道弧菌(V.ichthyoenteri)、鰻弧菌(V.anguillarum)、哈維氏弧菌(V.harveyi)由本實驗室保存。6周齡純種雌性新西蘭大白兔購自青島市藥品檢驗所。

1.2 副溶血弧菌多抗制備及效價測定

1.2.1副溶血弧菌兔多抗制備與純化 副溶血弧菌使用LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后用福爾馬林滅活。用0.01 mol·mL-1磷酸鹽緩沖液(PBS，pH= 7.4)調整菌體濃度至1.0×108cfu·mL-1，保存于-20 ℃?zhèn)溆?。滅活菌液?次免疫純種新西蘭大白兔，初次免疫將滅活菌液混入弗氏完全佐劑(1∶1, v/v)，背部6點皮下注射；1周后，將滅活菌液與弗氏不完全佐劑混勻(1∶1)，背部皮下注射免疫；間隔2周后重復免疫1次，然后在1周后耳緣靜脈注射滅活菌液。最后一次免疫1周后取血，將血液置于離心管中，室溫靜置1 h后，4 ℃過夜。次日，3 500×g離心15 min，取上清即為抗血清。

運用辛酸-硫酸銨法對兔抗血清進行純化?？寡逵?.06 mol·mL-1乙酸緩沖液(pH=4.0；1∶4，v/v)稀釋， 然后用0.1 mol·mL-1NaOH調整血清稀釋液pH至4.5；室溫下，用電磁攪拌器邊攪拌邊緩慢滴加辛酸，1 mL血清稀釋液中加入25 μL辛酸，攪拌30 min。將混合液離心，收集上清并用45 pm微孔濾膜過濾，加入10%的無菌PBS，用5.0 mol·mL-1NaOH調整pH至7.4。冰浴條件下，按0.277 g·mL-1的終濃度緩慢加入硫酸銨粉末并攪拌均勻，4 ℃靜置過夜。次日，在4 ℃下離心，收集沉淀并用少量無菌PBS溶解，超純水中透析24 h；凍干后，將粉末用無菌PBS重懸至合適濃度并通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析純化的兔多抗，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 副溶血弧菌兔多抗效價測定 利用ELISA技術測定兔抗副溶血弧菌多抗的效價。在96孔酶標板中加入100 μL濃度為5×107cfu·mL-1副溶血弧菌菌液，包被過夜，次日用含0.05% Tween-20的PBST洗滌，每孔加入200 μL的3%牛血清白蛋白(BSA)，37 ℃封閉1 h；PBST再次洗滌后，每孔加入100 μL梯度稀釋的副溶血弧菌兔多抗，設置3個平行， PBS為陰性對照，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌后，每孔加入100 μL堿性磷酸酶(AP)標記羊抗兔IgG抗體，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌，再加入200 μL底物顯色液，避光發(fā)色5 min后酶標儀測定OD405值。

1.3 副溶血弧菌抗原組分的提取

1.3.1 外膜蛋白的提取 副溶血弧菌外膜蛋白的提取參考熊焰等的方法[16]。將擴大培養(yǎng)后的副溶血弧菌離心，無菌PBS洗滌后重懸至原菌液體積1/25，加入少量10%蔗糖，室溫下混勻后，置于-20 ℃下作用15 min；取出混合液，加入等體積0.4% Triton-X100，攪拌混勻作用30 min，10 000 ×g離心30 min，取上清并用0.45 pm微孔濾膜過濾，冰浴條件下緩慢加入2.5倍體積冷無水乙醇(4 ℃)，-20 ℃靜置過夜；次日，混合液于4 ℃、10 000×g離心30 min，沉淀經過Tris-NaCl洗滌重懸后，加入等體積0.6 mol·L-1碘化鉀溶液，37 ℃作用1 h后離心，取上清于冰浴條件下加入2.5倍體積4 ℃的無水乙醇， -20 ℃靜置過夜。次日，將混合液4 ℃下離心，無菌PBS重懸沉淀，采用上述 SDS-PAGE分析外膜蛋白。SDS-PAGE結束后，取出凝膠放在CuCl2可逆染色液中染色，黑背景光照條件下觀察蛋白帶，切取主要蛋白條帶，于脫色液中脫色，超純水沖洗膠條3次。將膠條切成小塊后裝入透析袋中，加入洗脫緩沖液，置于水平電泳儀中恒流40 mA電泳8 h。電泳結束后，逆轉電流電泳5 min，吸出洗脫緩沖液，超純水中透析24 h。凍干后，無菌PBS溶解，Bradford法[17]測定濃度，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 鞭毛蛋白的提取 副溶血弧菌鞭毛蛋白的提取參考張曉佩等[18]方法并略有改動。將培養(yǎng)的副溶血弧菌離心后，用無菌0.01 mol·mL-1PBS洗滌并重懸至原菌液體積的1/20；用1.0 mol·mL-1鹽酸將菌液的pH調整至2.0，室溫攪拌30 min，然后4 ℃、1 500 ×g離心30 min，取上清液4 ℃、533 000×g離心1 h，用1 mol·mL-1NaOH調整上清液pH至7.2。在冰浴條件下，加入硫酸銨粉末至終濃度為2.67 mol·mL-1，攪拌30 min，4 ℃靜置過夜。次日，4 ℃下再次離心15 min，取沉淀溶于無菌PBS中，SDS-PAGE分析后，切膠回收主要條帶蛋白，洗脫收集蛋白，超純水中透析24 h。凍干后，粉末溶于PBS中，Bradford法測定濃度。

1.3.3 胞外產物的提取 根據Inamura等[19]的方法提取副溶血弧菌的鞭毛蛋白。副溶血弧菌于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，取1 mL的液體培養(yǎng)物在每個預先放置了一層賽璐玢的LB瓊脂平板上涂布均勻，37 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h；每個平板用無菌PBS洗下菌體；收集菌懸液，在4 ℃下7 000×g離心30 min，收集上清。冰浴條件下，加入硫酸銨粉末至終濃度為2.0 mol·mL-1，攪拌后4 ℃放置過夜。次日，4 ℃下10 000×g離心1 h，無菌PBS重懸沉淀，SDS-PAGE分析后，切膠回收主要條帶蛋白，洗脫收集蛋白，用超純水透析24 h。凍干后，無菌PBS調至合適濃度，Bradford法測定濃度，-80 ℃凍存。

1.3.4 全菌破碎蛋白的制備 將副溶血弧菌濃度調至1×108cfu·mL-1，超聲波破碎儀破碎(Sonics & Materials；振幅39%；pulse on，3 s；pulse off，3 s)至液體澄清，即為副溶血弧菌破碎蛋白。然后，超純水中透析、凍干，粉末用PBS溶解，Bradford法測定濃度，于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 間接ELISA法分析免疫交叉反應

為了分析副溶血弧菌兔多抗與其他弧菌的交叉反應性，同樣方法提取了溶藻弧菌、魚腸道弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌破碎蛋白，運用間接ELISA分析副溶血弧菌兔多抗與這些抗原蛋白的免疫反應。將抗原蛋白分別于96孔酶標板中4 ℃過夜，每種蛋白設3個平行，以無菌0.01 mol·mL-1PBS作為陰性對照；次日， PBST洗滌3次，加入3% BSA，于37 ℃封閉1 h，PBST洗滌后加入兔抗副溶血弧菌多抗(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌后加入100 μL AP標記的羊抗兔IgG(1∶8 000)，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌，加入底物顯色液，暗處反應10～20 min，然后加入2 mol·mL-1NaOH溶液終止顯色反應， 405 nm處檢測OD值。計算各實驗孔與陰性對照光吸收值之比(P/N)，當P/N≥2.1時為陽性。計算4種抗原蛋白間的P/N值，繪制“P/N值-抗原蛋白”直方圖，根據直方圖分析免疫交叉。

1.5 膠體金最適標記蛋白濃度的確定及金標抗體的制備

按照我們前期使用的方法制備膠體金[15]，透射電鏡觀察確定膠體金顆粒大小一致，形態(tài)呈橢球形或球形，無聚團現(xiàn)象后用于實驗。用0.1 mol·mL-1碳酸鉀溶液和0.1 mol·mL-1鹽酸將制得的20 nm膠體金pH調至8.4[15]，然后將膠體金設置10個濃度梯度(分別為1～10 μg·mL-1)，每個濃度取出1 mL膠體金，分別加入10 μL不同濃度的副溶血弧菌兔多抗，迅速混勻，室溫下靜置30 min后加入10 μL 5% 的NaCl，混勻后室溫靜置2 h。分光光度計測定每個濃度梯度在520 nm處的OD值，以OD值為縱軸、蛋白濃度為橫軸制作曲線圖，取曲線中OD值最大處對應的兔多抗用量為穩(wěn)定膠體金的最低蛋白量，在此基礎上加20%的蛋白標記量即是最適合的蛋白標記濃度。

用0.1 mol·L-1碳酸鉀將膠體金pH調至8.4[15]，按照確定的最合適標記濃度加入副溶血弧菌兔多抗，攪拌20 min后于室溫下靜置10 min；用BSA調整使其終濃度為1%，然后攪拌15 min，室溫靜置10 min；4 ℃下1 200×g離心15 min，取上清液經13 500×g(4 ℃)離心30 min。取沉淀，金標多抗洗滌液(含1% BSA的0.01 mol·L-1PBS，pH=8.4)洗滌后離心，取沉淀，金標多抗保存液(0.01 mol·L-1PBS中含3%蔗糖，1% BSA，0.2% Tween-20和0.02% NaN3，pH=8.4)重懸沉淀至原來體積的1/10，即為金標兔抗副溶血弧菌多抗。

1.6 4條檢測線抗原蛋白特異性及劃線濃度的確定

利用間接ELISA法測定副溶血弧菌4種抗原蛋白在相應檢測線上的劃線濃度。在96孔酶標板中加入副溶血弧菌的4種抗原蛋白，每種蛋白設置3個平行，陰性對照為無菌PBS，4 ℃包被過夜；次日， PBST洗3次，然后用 3%的BSA于37 ℃封閉1 h；PBST洗滌后，加入副溶血弧菌兔多抗(1∶2 000)于37 ℃孵育1 h； PBST洗滌后，加入 AP標記的羊抗兔IgG(1∶8 000)于37 ℃孵育1 h；PBST洗滌，加入底物顯色液放于暗處10～20 min，后加入NaOH溶液終止顯色反應， 405 nm處檢測OD值。計算各實驗孔與陰性對照孔的光吸收值之比(P/N)，P/N≥2.1顯示為陽性。計算4種抗原蛋白間的P/N比值，并根據P/N比值和蛋白包被濃度來確定劃線濃度。

1.7 副溶血弧菌快速檢測試紙的結構設計

根據交叉反應分析結果，將病原菌的多種抗原組分排列在一起時，它們能夠同時與該病原菌的抗體發(fā)生反應，而其他菌只有共同抗原發(fā)生反應。由此，將副溶血弧菌的4種抗原排列在一起作為4條檢測線(T1～T4，制備詳見1.8.1)，并將T4線設計為全菌蛋白，用金標副溶血弧菌抗體制備金標墊，羊抗兔IgG作為質控抗體，設計副溶血弧菌快速檢測試紙。利用競爭免疫層析技術進行檢測，待檢樣品中的副溶血弧菌會與檢測線上的抗原蛋白競爭結合金標墊上的金標副溶血弧菌抗體，使檢測線上的抗原無法與金標副溶血弧菌抗體反應，檢測線全部不顯色；若待檢樣品中不含副溶血弧菌，檢測線上的抗原就會與金標副溶血弧菌抗體結合，檢測線全部顯色；若待檢樣品中含有其他病原菌，只有其共同抗原與檢測線上的副溶血弧菌抗原競爭結合金標抗體，部分檢測線不顯色。

1.8 副溶血弧菌快速檢測試紙的制備

1.8.1 金標墊及檢測層的制備 將玻璃纖維膜四周寬0.5 cm的邊緣整齊的裁剪掉，并將玻璃纖維膜裁成寬0.8 cm的小條。將新制備的金標兔抗副溶血弧菌多抗用噴膜儀(Biodot，XYZ3060)均勻地噴涂在玻璃纖維膜小條上，冷凍干燥，避光封存?zhèn)溆谩?/p>

將副溶血弧菌4種抗原蛋白的濃度分別調至1.5節(jié)中所確定的劃線濃度，用噴膜儀將外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌蛋白均勻噴涂于硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線T1、T2、T3和T4，4條檢測線之間相距1.5 mm。將0.5 mg·mL-1羊抗兔IgG噴涂于硝酸纖維膜上作為質控線，與T4相距5 mm，靠近吸水墊，而檢測線T1靠近樣品墊(見圖1)。

1.8.2 試紙條的組裝 取出PVC底板，將準備好的硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊和吸水墊依次粘貼，組裝成試紙條整版。組裝示意圖如圖1所示，首先粘貼上硝酸纖維膜，其次是吸水墊和金標墊，其中硝酸纖維膜的上端邊緣重疊于吸水墊邊緣之下，硝酸纖維素膜的下端邊緣覆蓋于金標墊上端邊緣之下，最后組裝樣品墊(樣品墊的上端邊緣重疊在金標墊的下端邊緣之上)。用切條機裁剪組裝好的試紙條，寬度設置為3.75 mm。裁剪好的試紙條裝入塑料卡盒中，密封于有干燥劑的鋁箔小袋中，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

(1.樣品墊；2.金標墊；3～6.檢測線T1～T4(T線)，分別噴涂副溶血弧菌外膜蛋白(T1)、鞭毛蛋白(T2)、胞外產物(T3)和全菌蛋白(T4)；7. 硝酸纖維素膜(NC膜)；8. 質控線(C線)；9. PVC底板；10.吸水墊。1. Sample pad；2. Glass fiber containing anti-V. parahaemolyticus polyclonal antibody；3～6. Outer membrane protein (T1), flagellum protein (T2), extracellular products (T3) and whole-cell bacterial protein (T4) of V. parahaemolyticus were used as test lines (T lines) respectively； 7. Nitrocellulose membrane；8. Control Line (C line); 9. PVC board；10. Absorption pad.)

1.9 檢測試紙的特異性

將副溶血弧菌、鰻弧菌、魚腸道弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌分別離心純化，用無菌0.01 mol·mL-1PBS(pH=7.4)調至濃度為1×107cfu·mL-1，用PBS作為陰性對照，使用制備的副溶血弧菌快速檢測試紙進行檢測，10 min后肉眼觀察檢測結果并拍照，確定試紙的檢測特異性。

1.10 檢測試紙的靈敏性

用無菌0.01 mol·mL-1PBS(pH=7.4)將副溶血弧菌調至5×107、5×106、5×105、5×104cfu·mL-14個濃度，使用制備的副溶血弧菌快速檢測試紙進行檢測，10 min后肉眼觀察檢測結果并拍照，確定試紙的檢測靈敏性。

1.11 牙鲆組織中副溶血弧菌的檢測

取感染了副溶血弧菌發(fā)病的牙鲆肝、脾、腎組織混合，每1 g組織樣品用5 mL無菌PBS在冰浴條件下充分研磨3～5 min，用篩絹過濾得到的研磨液作為檢測樣品液，使用制備的副溶血弧菌檢測試紙進行檢測，健康的牙鲆組織液和無菌PBS分別作為陰性對照。

采用ELISA實驗作為對照，上述患病牙鲆的檢測樣品液為包被液，檢測牙鲆組織中的副溶血弧菌，確定快速檢測試紙的檢測準確性。

2 結果

2.1 副溶血弧菌兔多抗的效價

純化的副溶血弧菌兔多抗包括IgG重鏈和輕鏈蛋白，說明純化抗體可用于膠體金檢測試紙的制備(見圖2 A的條帶)。ELISA檢測結果顯示(見表1)，副溶血弧菌兔多抗的稀釋倍數低于1×105時，其OD405值皆大于陰性對照PBS的OD405值的2倍，而當抗體稀釋倍數為2×105時，OD405值小于陰性對照的OD405值的2倍，所以制備的副溶血弧菌兔多抗的效價為1×105。

(M：蛋白質分子量標準；A：副溶血弧菌兔多抗。M: Marker； A: Anti-V. parahaemolyticus polyclonal antibody.)

表1 副溶血弧菌兔多抗的效價

2.2 副溶血弧菌抗原組分SDS-PAGE分析結果

SDS-PAGE圖譜顯示(見圖 3)，副溶血弧菌外膜蛋白條帶主要位于42、38、36、32和26 kDa；鞭毛蛋白主要條帶位于72、 37和32 kDa；胞外產物主要條帶位于37、28、26、22和18 kDa。選取這些主要蛋白用作快速檢測試紙的檢測線抗原蛋白。

(M：蛋白質分子量標準；A：外膜蛋白；B：鞭毛蛋白；C：胞外產物。M: Marker； A: Outer membrane protein； B: Flagellin protein； C: Extracellular products of V. parahaemolyticus.)

2.3 免疫交叉分析結果

副溶血弧菌兔多抗與副溶血弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌蛋白的免疫反應呈現(xiàn)強陽性，與溶藻弧菌的外膜蛋白和全菌蛋白、魚腸道弧菌的全菌蛋白、哈維氏弧菌的胞外產物也呈現(xiàn)陽性或弱陽性，表明副溶血弧菌兔多抗與這些抗原有不同程度的免疫交叉反應。副溶血弧菌兔多抗與鰻弧菌的4種抗原組分沒有明顯的交叉反應(見圖4)。

(A1～A4：副溶血弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌蛋白；B1～B4：溶藻弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌蛋白；C1～C4：鰻弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌蛋白；D1～D4：魚腸道弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌蛋白；E1～E4：哈維氏弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌蛋白；虛線：P/N =2.1。 A1～A4: Outer membrane protein, flagellum protein, extracellular products and whole-cell bacterial protein of V. parahaemolyticus; B1～B4: Outer membrane protein, flagellum protein, extracellular products and whole-cell bacterial protein of V. alginolyticus; C1～C4: Outer membrane protein, flagellum protein, extracellular products and whole-cell bacterial protein of V. anguillarum; D1～D4: Outer membrane protein, flagellum protein, extracellular products and whole-cell bacterial protein of V. ichthyoenteri; E1～E4: Outer membrane protein, flagellum protein, extracellular products and whole-cell bacterial protein of V. harveyi; The dashed line represented P/N = 2.1.)

2.4 膠體金最適標記蛋白濃度

OD值法測定副溶血弧菌兔多抗標記膠體金的最佳蛋白量，結果顯示蛋白濃度小于3 μg·mL-1時，膠體金的OD值呈上升趨勢；蛋白濃度大于3 μg·mL-1時，OD值呈下降趨勢后趨于平緩，表明3 μg·mL-1為穩(wěn)定膠體金的最低蛋白量，最佳標記濃度為3.6 μg·mL-1(最低蛋白量基礎上加20%，見圖 5)。

圖5 OD值曲線法確定膠體金標記副溶血弧菌兔多抗的最佳標記濃度

2.5 4種抗原蛋白特異性及劃線濃度

副溶血弧菌4種蛋白的OD405值與PBS OD405值的比值(P/N值)皆大于等于2.1，表明4種抗原蛋白均可與副溶血弧菌兔多抗特異性結合(見表2)。根據4種抗原蛋白的濃度和P/N值確定副溶血弧菌快速檢測試紙的4條檢測線T1、T2、T3和T4上的抗原蛋白劃線濃度，分別為外膜蛋白0.8 mg·mL-1、鞭毛蛋白0.3 mg·mL-1、胞外產物1.0 mg·mL-1、全菌蛋白0.4 mg·mL-1。

表2 ELISA法確定副溶血弧菌4種抗原蛋白的劃線濃度Table 2 The dispensed concentration of four antigens of V. parahaemolyticus determined by ELISA

2.6 檢測結果的判讀方法

根據競爭免疫層析法原理，副溶血弧菌快速檢測試紙檢測結果的判讀方法如下(見圖6A)：(1)質控線(C線)顯色，4條檢測線T1～T4全部不顯色，表明檢測樣品中含有副溶血弧菌與檢測線上的抗原蛋白競爭結合金標副溶血弧菌抗體，結果為陽性；(2)質控線顯色，4條檢測線T1～T4全部顯色，表明檢測樣品中不含副溶血弧菌，金標副溶血弧菌抗體與檢測線上的抗原結合而顯色，結果為陰性；(3)質控線顯色，檢測線T4線呈現(xiàn)紅色，而檢測線T1、T2、T3中個別條帶不顯色，表明檢測樣品中不含副溶血弧菌，但含有與副溶血弧菌具有共同抗原的其他病原菌，結果為其他菌的交叉反應；(4)質控線和檢測線T1～T4都不顯色，表明該試紙失效或操作出現(xiàn)問題。

2.7 試紙的特異性

對鰻弧菌、魚腸道弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌使用制備的副溶血弧菌快速檢測試紙進行檢測，結果如圖6B所示，當檢測鰻弧菌、魚腸道弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌時(見圖6B 1～4)，質控線和T1～T4檢測線皆顯色，表明結果為副溶血弧菌陰性，但是魚腸道弧菌(見圖6B-2)、溶藻弧菌(見圖6B-3)使T4檢測線較PBS組(見圖6B-5)變淺，哈維氏弧菌的T2、T3線較PBS組變淺，表明存在一定程度的交叉反應；PBS使C線和4條T線皆顯色；檢測副溶血弧菌時，僅C線顯色，4條檢測線皆不顯色，即檢測結果為陽性(見圖6B-6)。

(A: Ⅰ. 陽性結果；Ⅱ. 陰性結果；Ⅲ. 交叉反應；Ⅳ. 試紙失效。B: 1. 鰻弧菌檢測結果；2. 魚腸道弧菌檢測結果；3. 溶藻弧菌檢測結果；4. 哈維氏弧菌檢測結果；5. PBS陰性對照；6. 副溶血弧菌檢測陽性結果。A: Ⅰ. Positive results；Ⅱ. Negative results；Ⅲ. Cross reaction；Ⅳ. Invalid results. B: 1. V. anguillarum；2. V. ichthyoenteri；3. V. alginolyticus；4. V. harveyi；5. PBS；6. V. parahaemolyticus.)

2.8 試紙的靈敏性

使用制備的副溶血弧菌快速檢測試紙檢測5×107、5×106、5×105、5×104cfu·mL-1的副溶血弧菌，發(fā)現(xiàn)在檢測5×107、5×106、5×105cfu·mL-1的副溶血弧菌時，質控線顯色而T1～T4線不顯色，濃度為5×104cfu·mL-1時，T1～T4線開始顯色，說明5×105cfu·mL-1即為該試紙的檢測限(見圖7)。

圖7 副溶血弧菌快速檢測試紙的檢測靈敏性

2.9 試紙的檢測準確性

使用副溶血弧菌快速檢測試紙檢測人工感染副溶血弧菌發(fā)病的牙鲆肝、脾、腎混合樣品，發(fā)現(xiàn)T1～T4檢測線皆不顯色，只有質控線顯色，結果判定為陽性；而健康牙鲆組織樣品和PBS使4條檢測線和質控線皆顯色，結果判定為陰性(見圖8)。

(i：健康牙鲆組織樣品檢測結果；ii：PBS陰性對照；iii：患病牙鲆組織檢測結果。i： Negative control using the tissues of healthy flounder；ii： Negative control using PBS；iii： Positive results for V. parahaemolyticus in flounder.)

ELISA的結果顯示牙鲆組織樣品OD值與健康牙鲆組織陰性對照組OD值的比值(P/N值)大于2.1，表明為副溶血弧菌陽性(見圖9)，與試紙的檢測結果一致。

圖9 ELISA檢測牙鲆樣品中副溶血弧菌

3 討論

副溶血弧菌可引起水產養(yǎng)殖魚、蝦、蟹、貝等經濟動物的流行性和暴發(fā)性死亡[2-3]，是水產動物特別是海水魚類弧菌病的主要致病菌，有時會與溶藻弧菌、哈維氏弧菌等發(fā)生混合感染[20]，而食用被副溶血弧菌污染的海產品可引起急性腸胃炎、敗血病等疾病[4-5]。傳統(tǒng)的副溶血弧菌核酸和免疫學檢測技術多局限于實驗室檢測，耗時長、需要專業(yè)儀器和人員，不適用于現(xiàn)場的實時檢測，檢測結果滯后無法滿足養(yǎng)殖者及時制定防控決策的需求，延誤治療時機，急需快速、簡便、準確的現(xiàn)場檢測診斷技術。免疫膠體金技術是一種很有發(fā)展前景的現(xiàn)場檢測技術，但是排除病原菌之間免疫交叉反應對結果判定的干擾是其需要解決的關鍵問題。本文使用副溶血弧菌4種抗原蛋白作為4條檢測線，4種檢測線抗原設置不同濃度，并在T4線設置全菌蛋白，采用競爭免疫層析原理制備了副溶血弧菌快速檢測試紙，確定了4條檢測線同時不顯色判定為陽性，同時顯色判定為陰性，個別檢測線不顯色則為交叉反應的結果判定方法，對患病牙鲆組織的檢測結果表明該試紙可以用于副溶血弧菌的準確檢測。

為了解決免疫學檢測技術存在的免疫交叉反應干擾檢測準確性的問題，一般是通過篩選病原獨有的抗原或特異性抗體的策略，但是費時費力。本文制備了副溶血弧菌兔多抗，分析了副溶血弧菌抗體與5種弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物及全菌蛋白的免疫交叉反應，發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌與其自身的4種抗原蛋白皆發(fā)生較強的結合反應，但僅與其他弧菌的個別共同抗原發(fā)生較弱的交叉反應，根據此現(xiàn)象，如果增加抗原蛋白種類數作為多條檢測線，可根據所有抗原蛋白同時與病原菌抗體反應則為陽性結果，個別抗原反應則為交叉反應，從而將二者區(qū)分開。本文同時使用副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌蛋白作為4條檢測線，利用副溶血弧菌抗體作為金標抗體，根據競爭免疫層析原理，當檢測樣品中含有副溶血弧菌時，則會與金標副溶血弧菌抗體結合，導致檢測線上4種抗原蛋白無法與金標副溶血弧菌抗體的結合，從而4條檢測線同時不顯色；相反，則同時顯色；如果檢測樣品中含有其他菌，則其含有的共同抗原與檢測線上副溶血弧菌的相應抗原競爭結合金標抗體，從而使該檢測線不顯色或著顏色變淺，可以判定為交叉反應。為了避免其他菌含有多種共同抗原而出現(xiàn)所有檢測線皆不顯色的情況，本研究在T4線上特別設置了副溶血弧菌全菌蛋白，因全菌蛋白中一定含有除共同抗原以外的其他抗原蛋白，這些抗原蛋白與金標副溶血弧菌抗體反應而使T4線顯色，從而避免其他菌使4條檢測線同時不顯色而造成假陽性。目前，文獻報道的膠體金快速檢測試紙一般設置一條檢測線，或者在多條檢測線上噴涂不同濃度的相同抗原/抗體從而實現(xiàn)定量檢測[21-22]，本文采用了將4種抗原作為4條檢測線來檢測一種病原菌的策略。另外，因為副溶血弧菌中不同抗原組分的含量不同，為了使4條檢測線能夠同時顯色或同時不顯色，本文利用ELISA測定了4種抗原組分與副溶血弧菌兔多抗反應的OD值，計算其與陰性對照的P/N值，根據P/N值確定檢測線上外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌蛋白4種抗原蛋白的劃線濃度分別為0.8、0.3、1.0 和0.4 mg·mL-1。利用制備的副溶血弧菌快速檢測試紙對鰻弧菌、魚腸道弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌進行檢測，只有副溶血弧菌使4條檢測線同時不顯色，其他弧菌使部分檢測線顏色變淺，根據本文確定的結果判定方法，可以準確區(qū)分副溶血弧菌感染及其他菌的交叉反應，即其他弧菌的交叉反應不會影響對副溶血弧菌檢測結果的準確判斷，而對人工感染的牙鲆組織的檢測結果也與ELISA結果一致，表明制備的試紙具有很好的特異性和檢測準確性。對于副溶血弧菌與其他病原菌混合感染的情況，使用該試紙只能檢測到副溶血弧菌陽性，其他菌的存在不會影響副溶血弧菌的準確鑒定，但該試紙無法鑒別混合感染，需要聯(lián)合使用其他病原菌快速檢測試紙或者借助于多病原高通量檢測技術鑒別混合感染。本實驗室前期曾研制了鰻弧菌、海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)、 熒 光 假 單 胞 菌(Psedomonasfluorescens)、 遲 緩 愛 德 華 氏 菌(Edwardsiellatarda)及海分支桿菌(Mycobacteriummarinum)6 種病原菌同步檢測免疫芯片[26]，以及副溶血弧菌、魚腸道弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌和河流弧菌(Vibriofluvialis)的血清學診斷抗原芯片[27]，適用于混合感染情況下的多病原同步鑒別。因此，該試紙可以用于副溶血弧菌感染的大量樣品的快速初篩，聯(lián)合使用其他病原菌的快速檢測試紙或者配合使用多病原高通量檢測技術可以解決混合感染情況下病原的準確鑒別問題。

目前，檢測病原菌的膠體金免疫層析試紙的靈敏度一般在105～106cfu·mL-1[23-25]，本文制備的副溶血弧菌快速檢測試紙的靈敏度為5×105cfu·mL-1，達到了同類試紙的檢測水平。但是，樣品中副溶血弧菌濃度低于5×105cfu·mL-1時，4條檢測線會顯色，從而出現(xiàn)假陰性結果，限制了其在感染早期的病原檢測中的應用，因此，還有待于通過優(yōu)化抗體及其他實驗條件參數提高靈敏度。

4 結語

本文基于競爭免疫層析原理制備的副溶血弧菌快速檢測試紙具有很好的檢測特異性和準確性，制備試紙時僅需要制備副溶血弧菌兔多抗作為金標抗體，提取其外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌蛋白作為4條檢測線(T1～T4)，無需篩選特異性抗原/抗體，即可實現(xiàn)副溶血弧菌的準確檢測，不受其他菌交叉反應的干擾。使用該試紙進行檢測，操作簡便快速，可以在10 min內得到肉眼直視的檢測結果，適用于病原性副溶血弧菌的現(xiàn)場快速檢測，具有較高實用價值，研究結果為水產養(yǎng)殖中副溶血弧菌的快速檢測提供了有力工具。