楊金鑫, 張贏月, 楊 澤, 閆 昊, 徐 滌, 張學(xué)成

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院, 海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266003)

近二十年來(lái)，產(chǎn)瓊膠江蘺科紅藻龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)的產(chǎn)業(yè)化栽培在中國(guó)發(fā)展很快，截止2018年已達(dá)年產(chǎn)量30萬(wàn)t干品規(guī)模，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和凈化栽培海區(qū)水質(zhì)的生態(tài)效益[1-2]。此外，在夏季缺乏其他新鮮餌料的情況下，龍須菜還作為養(yǎng)殖鮑魚的輔助餌料得到很好的效果[3]，因此市場(chǎng)需求量逐年增加。

野生龍須菜分布于山東沿海潮間帶，一年中有兩次生長(zhǎng)和繁殖季節(jié)，而在溫度太高的夏季和溫度太低的冬季基本不生長(zhǎng)[4]。為了延長(zhǎng)其生長(zhǎng)期從而擴(kuò)大產(chǎn)量，人們選擇了南移栽培方式，在福建首次獲得了龍須菜栽培的成功，栽培時(shí)間可以從秋季一直延續(xù)到來(lái)年的春季形成一個(gè)完整的養(yǎng)殖周期。隨著幾個(gè)龍須菜優(yōu)良新品種的研發(fā)[5-7]，其耐高溫的性狀得到提升，在北方海域也可以連續(xù)從晚春至秋季的生長(zhǎng)，因此近幾年來(lái)逐漸形成了一個(gè)龍須菜南北輪栽的新栽培模式[1]。這不僅可以提高龍須菜的產(chǎn)量，還滿足了南北方相互間提供大量苗種的需求。

龍須菜栽培與其他江蘺科物種一樣，采用的都是人工夾苗的方式[8]。目前所有的龍須菜栽培品種都是二倍體的四分孢子體世代，依賴營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)進(jìn)行培養(yǎng)。這種栽培方法簡(jiǎn)單易行，但也存在著一些明顯的不足：首先，需要大量的藻體作為苗種，藻枝的保存是主要困難。盡管目前南北輪栽模式較好地解決了這一問(wèn)題，但長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)某杀竞惋L(fēng)險(xiǎn)依然較高。第二，長(zhǎng)期僅依靠營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)會(huì)造成整個(gè)栽培海域藻種遺傳多樣性低，大規(guī)模病害發(fā)生幾率大，同時(shí)藻體本身還會(huì)發(fā)生種質(zhì)退化等問(wèn)題[9]。中國(guó)另外幾個(gè)重要的海藻栽培物種，如海帶、紫菜等早已實(shí)現(xiàn)了培育生活史中某一階段的孢子來(lái)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，盡管育種過(guò)程會(huì)增加時(shí)間及成本，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)看不僅可以保證優(yōu)良苗種的保存和供給，同時(shí)也便于對(duì)種質(zhì)進(jìn)行后續(xù)的改良，有利于栽培產(chǎn)業(yè)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展。

鑒于以上原因，學(xué)者們?cè)缫验_(kāi)始探究利用孢子萌發(fā)實(shí)現(xiàn)江蘺物種的人工栽培方法，例如大量采集智利江蘺(Gracilariachilensis)釋放的四分孢子并附著在石片或網(wǎng)繩上進(jìn)行萌發(fā)，證明了使用孢子對(duì)江蘺進(jìn)行繁殖是可行的[10-11]；在夏威夷養(yǎng)殖的Gracilariaparvispora也進(jìn)行了采集果孢子進(jìn)行附著和擴(kuò)大化栽培的成功試驗(yàn)[12-13]；Zhou等的工作同樣表明可以通過(guò)采集四分孢子或果孢子對(duì)龍須菜實(shí)行規(guī)?；敝砙14-15]。

如果要實(shí)現(xiàn)江蘺的孢子采苗生產(chǎn)方式，則必須能在實(shí)驗(yàn)室保存優(yōu)良品系的藻株并建立起一套促進(jìn)孢子形成和釋放的方法和流程。但到目前，對(duì)孢子放散過(guò)程和存活率影響條件的研究較多[12,14,16-17]，而對(duì)孢子形成過(guò)程的影響因子研究較少。本實(shí)驗(yàn)將使用在實(shí)驗(yàn)室培育的由四分孢子萌發(fā)長(zhǎng)成的龍須菜雌、雄配子體共培養(yǎng)進(jìn)行受精，測(cè)試雌雄配子體藻枝部位、溫度、硝酸鹽濃度等因素對(duì)果孢子體形成過(guò)程的影響。

1 材料與方法

1.1 用于雜交實(shí)驗(yàn)的龍須菜雌、雄配子體

本研究采用的一對(duì)龍須菜雌、雄配子體來(lái)自于在本實(shí)驗(yàn)室采集和培育的由四分孢子發(fā)育的配子體。野生的成熟龍須菜四分孢子體采集自青島浮山灣，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行了四分孢子的采集，待孢子萌發(fā)后逐一進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：使用改良的f/2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)[18]，光照50 μmol·m-2·s-1，溫度20 ℃，光周期L∶D= 12 h∶12 h。成熟的配子體通過(guò)兩兩雜交確定性別，最后確定使用一對(duì)雌、雄配子體進(jìn)行擴(kuò)培和實(shí)驗(yàn)以確保數(shù)據(jù)不會(huì)因?yàn)閭€(gè)體遺傳差異而產(chǎn)生偏差。

如無(wú)特別說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)所用雌雄配子體藻段都是保留有尖部生長(zhǎng)點(diǎn)且長(zhǎng)度大約為5 cm的一級(jí)分枝藻段。

1.2 龍須菜雌雄配子體的受精

將上述龍須菜雄配子體和雌配子體藻段放在一個(gè)三角瓶中進(jìn)行受精。如無(wú)特殊說(shuō)明基本培養(yǎng)條件同2.1，實(shí)驗(yàn)期間不更換培養(yǎng)基。約10 d后可以在雌配子體表面觀察到果孢子體的形成，所有實(shí)驗(yàn)組在第20天進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 雄配子體藻枝部位對(duì)果孢子體形成的影響

將一條長(zhǎng)約6 cm的帶有尖部生長(zhǎng)點(diǎn)的雄性配子體藻段切開(kāi)，分為上部和下部2個(gè)組，每段均在3 cm左右，然后分別與雌配子體進(jìn)行雜交。每一個(gè)培養(yǎng)瓶中放入2條雄配子體藻段和3條雌配子體藻段，2組各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4 雌配子體藻枝部位對(duì)果孢子體形成的影響

事先將雌配子體通氣培養(yǎng)，以促進(jìn)分枝萌發(fā)，以確保每條雌配子體上至少有2個(gè)二級(jí)分枝[19]，此時(shí)的雌配子體藻段都大于10 cm。每一個(gè)培養(yǎng)瓶中放入1條雄配子體和1條上述雌配子體，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察果孢子體形成的位置。

1.5 溫度對(duì)果孢子體形成的影響

實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置10、15、20、25和30 ℃，5個(gè)不同溫度條件對(duì)龍須菜雌雄配子體進(jìn)行雜交。每個(gè)培養(yǎng)瓶中放入1條雄配子體藻段和3條雌配子體藻段，每組各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6 硝酸鹽濃度對(duì)果孢子體形成的影響

實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置0.5、1、5和10 mmol/L，4個(gè)硝酸鹽濃度對(duì)龍須菜雌雄配子體進(jìn)行雜交。進(jìn)行該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)時(shí)f/2培養(yǎng)基中原有的硝酸鹽未加入，但海水中的硝酸鹽(約為0.2 mg/L)未計(jì)算在內(nèi)[20]。每個(gè)培養(yǎng)瓶中放入1條雄配子體藻段和3條雌配子體藻段，每組各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各實(shí)驗(yàn)組在雜交的第20天記錄雌配子體上果孢子體的總數(shù)，然后計(jì)算平均每厘米雌配子體上的果孢子體數(shù)量。

數(shù)據(jù)采用ANOVA分析及t-檢驗(yàn)來(lái)確定各實(shí)驗(yàn)組果孢子體數(shù)的差異，P<0.05為差異顯著，P<0.01為極顯著。各圖數(shù)據(jù)上都標(biāo)明標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)誤差線。

2 結(jié)果

2.1 雄配子體藻枝部位對(duì)果孢子體形成的影響

圖1為兩種不同的雄配子體藻枝部位受精所形成的果孢子體數(shù)量的比較。統(tǒng)計(jì)分析表明P>0.05，說(shuō)明兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間產(chǎn)生的果孢子體的數(shù)量無(wú)顯著差異。

圖1 雄配子體的不同部位受精形成的果孢子體數(shù)量比較

2.2 雌配子體藻枝部位對(duì)果孢子體形成的影響

圖2為雌配子體不同等級(jí)分枝上形成果孢子體數(shù)量的比較，從圖中可以看出，雌配子體一級(jí)分枝上形成的果孢子體數(shù)量顯著高于二級(jí)分枝上的果孢子體(P<0.01)。

圖2 雌配子體不同等級(jí)分枝上形成果孢子體數(shù)量的比較

根據(jù)多次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，龍須菜的果孢子體主要形成于一級(jí)分枝上。如圖3所示，一級(jí)分枝上的果孢子體比在二級(jí)分枝上的分布密集，在本實(shí)驗(yàn)中每厘米藻枝上的果孢子體數(shù)量約為二級(jí)分枝上的5倍。而且在一級(jí)分枝上，果孢子體可以在接近最頂端的區(qū)域形成，而二次分枝的尖端區(qū)域沒(méi)有果孢子體生長(zhǎng)。據(jù)觀察，一般小于1.5 cm的二級(jí)分枝上不會(huì)形成果孢子體，而較長(zhǎng)的二級(jí)分枝距尖端約1.5 cm內(nèi)也同樣沒(méi)有果孢子體形成。

圖3 雌配子體不同分枝上的果孢子體分布

2.3 溫度對(duì)果孢子體形成的影響

如圖4所示，溫度對(duì)果孢子體形成的影響極顯著(P<0.001)。在10～30 ℃所設(shè)置的5個(gè)組中，僅在20和25 ℃的條件下雌配子體上形成了果孢子體，而在較低或較高的溫度下都沒(méi)有形成。結(jié)果顯示20 ℃是受精的最佳溫度，形成果孢子體的數(shù)量最高，是25 ℃組的2倍以上。

圖4 溫度對(duì)果孢子體形成的影響

2.4 硝酸鹽濃度對(duì)果孢子體形成的影響

圖濃度對(duì)果孢子體形成的影響

3 討論

對(duì)江蘺果孢子采苗的研究往往針對(duì)其釋放及附著等后期的條件優(yōu)化，例如有報(bào)道溫度和光照會(huì)直接影響Gracilariacornea果孢子的釋放，但改變滲透壓和脫水處理的影響并不明顯[21-22]。Zhou等[14]分別對(duì)龍須菜果孢子的釋放和萌發(fā)過(guò)程進(jìn)行了影響因素的分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)果孢子體在8～10 d內(nèi)可以逐步釋放0～5 653個(gè)果孢子；同時(shí)，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的影響因素中只有溫度對(duì)果孢子的釋放具有極顯著的影響(P<0.01)，此外光強(qiáng)和鹽度也有影響(P<0.05)。但是這些報(bào)道都是采集野生的成熟藻體進(jìn)行的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，而如果要實(shí)現(xiàn)全人工采苗的龍須菜栽培技術(shù)就必須嘗試建立全程可控的雌雄配子體雜交受精體系，以獲得在數(shù)量上可滿足大規(guī)模栽培產(chǎn)業(yè)所需的且同步成熟的果孢子。對(duì)于這個(gè)方面的研究很少，Zhou等[14]曾對(duì)溫度、鹽度、光照等幾個(gè)因素進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有溫度對(duì)龍須菜受精過(guò)程有顯著影響(P<0.05)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)對(duì)龍須菜的雌雄配子體進(jìn)行受精來(lái)進(jìn)一步研究能夠影響該過(guò)程的內(nèi)外因素。由于紅藻的卵細(xì)胞，即果胞不釋放到環(huán)境中，受精過(guò)程是精子的細(xì)胞核通過(guò)果胞頂端的受精絲進(jìn)入后與果胞的細(xì)胞核進(jìn)行的。這個(gè)過(guò)程對(duì)龍須菜無(wú)法量化觀察，因此我們用單位長(zhǎng)度藻體上形成的合子數(shù)量，即寄生在雌配子體上的果孢子體數(shù)量來(lái)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，龍須菜雌配子體藻枝的不同部位會(huì)對(duì)受精過(guò)程產(chǎn)生影響。首先，不同等級(jí)分枝的雌配子體表現(xiàn)出不同的生殖力。Ye等[19]曾在野生龍須菜四分孢子體的研究中發(fā)現(xiàn)80%的四分孢子囊分布于一級(jí)分枝上。與此類似，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明一級(jí)分枝上的果孢子體比在二級(jí)分枝上分布的密集得多。其次，龍須菜為頂端生長(zhǎng)，一般認(rèn)為藻枝的尖端為新生部位，新生的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟的生殖細(xì)胞應(yīng)該需要一定的時(shí)間，因此成熟度可能不如中下部的藻枝。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示，無(wú)論是雄配子體還是雌配子體，成熟藻體一級(jí)分枝頂端部分的成熟度都并不是想象中那樣低，即整個(gè)藻體進(jìn)入成熟階段后，其一級(jí)分枝頂端的新生細(xì)胞轉(zhuǎn)化為生殖細(xì)胞的速度很快，這與藻體萌發(fā)后需要很長(zhǎng)時(shí)間才能從未成熟狀態(tài)進(jìn)入成熟狀態(tài)不同。實(shí)驗(yàn)表明，雄配子體上、下不同部位藻枝進(jìn)行受精的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組在形成果孢子體的數(shù)量上沒(méi)有明顯差別，一方面可能因?yàn)榫拥臄?shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)果胞數(shù)量，盡管最尖端的少部分藻枝沒(méi)有成熟，但上部藻枝余下的成熟部分已經(jīng)能夠提供足夠的成熟精子用于受精；而另一方面也說(shuō)明未成熟的頂端細(xì)胞比例應(yīng)該很小。這點(diǎn)從圖3中的雌配子體中同樣可以看出，對(duì)于一級(jí)分枝的雌配子體來(lái)說(shuō)，最尖端的未成熟部分應(yīng)該僅在1～2 mm內(nèi)，其它部位都能形成果孢子體，也就是說(shuō)這些部位有成熟的果胞形成。第三，雌配子體不同等級(jí)分枝的發(fā)育模式不同。如圖3所示，一級(jí)分枝上的果孢子體可以在接近最頂端的區(qū)域形成，說(shuō)明雌配子體頂端新生的藻細(xì)胞快速發(fā)育成熟形成果胞；而與此同時(shí)，二級(jí)分枝距尖部約1.5 cm的區(qū)域內(nèi)卻沒(méi)有果孢子體形成，說(shuō)明二級(jí)分枝頂端新生的藻細(xì)胞的成熟速度較慢。Wang等[17]對(duì)比了龍須菜四分孢子體一、二、三級(jí)分枝間的生長(zhǎng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)盡管一級(jí)分枝的光合活性最高，但從生物量的增長(zhǎng)速率來(lái)看反而不如二、三級(jí)分枝。綜合這些結(jié)果可以推測(cè)，一級(jí)分枝可能積累更多的能量用于生殖過(guò)程。

本文結(jié)果與Zhou等[14]都證實(shí)溫度是影響龍須菜受精過(guò)程的最重要的環(huán)境因素之一，而最適溫度的差異應(yīng)該與實(shí)驗(yàn)材料的選擇及其起始培養(yǎng)溫度有關(guān)，我們選用的是實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期培養(yǎng)的藻株而Zhou等[14]采用的是野生龍須菜。結(jié)果都顯示太高或太低溫度不利于龍須菜的受精過(guò)程，尤其是暫時(shí)的高溫(30 ℃)下盡管可以存活，但無(wú)法完成受精。本實(shí)驗(yàn)顯示受精結(jié)果在硝酸鹽在不同實(shí)驗(yàn)組間無(wú)明顯差異。

總之，要在龍須菜大規(guī)模生產(chǎn)上實(shí)現(xiàn)孢子采苗方式還有很多問(wèn)題亟待解決，都需要有穩(wěn)定的優(yōu)良品種來(lái)源、簡(jiǎn)便實(shí)用的采苗育種方式以及同步化生產(chǎn)技術(shù)。使用四分孢子或果孢子采苗各有利弊：四分孢子采苗的種源是四分孢子體，遺傳性質(zhì)比較穩(wěn)定，但釋放孢子數(shù)量不如果孢子，萌發(fā)的雌、雄配子體不僅生長(zhǎng)狀態(tài)有差別，還會(huì)將能量多用于有性生殖從而影響營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和收獲；而每個(gè)果孢子體可釋放大量遺傳背景相同的果孢子，萌發(fā)形成的四分孢子體生長(zhǎng)狀態(tài)相似，但前期需要雌雄配子體進(jìn)行受精來(lái)獲得。這里我們對(duì)受精過(guò)程的影響因素開(kāi)展了初步的工作，為龍須菜人工采苗技術(shù)的推進(jìn)提供思路和數(shù)據(jù)。