于肖鵬 李曉光 蘇慶琪 劉 桐 李騰宇 王延秀

口腔鱗狀細胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是目前臨床上常見的惡性腫瘤，現(xiàn)階段治療此病的最有效方法仍然是腫瘤手術(shù)切除，現(xiàn)在其預(yù)后不良的原因主要是腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)[1]，其轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的原因之一是OSCC 細胞的惡性增殖。Survivin 基因既有抑制腫瘤細胞凋亡作用，還有調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期的有絲分裂作用，其具有的雙重功能成為目前研究的熱點[2]。增殖細胞核抗原(Pr oliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)作為DNA 聚合酶的一種輔助性蛋白，能夠反應(yīng)出細胞的生長增殖情況[3，4]。本研究課題通過免疫組化的實驗方法，測定PCNA 和Survivin 蛋白在口腔鱗癌中的表達，研究Survivin 表達的意義，以及與PCNA 表達的相關(guān)性。

1.材料與方法

1.1 臨床資料及切片制備 OSCC 標(biāo)本共106例，來自2007 年1月至2017 年12月我院頜面外科病房手術(shù)切除組織，患者年齡34～78 歲，平均60.6 歲，其中女性41 例，男性65 例。根據(jù)術(shù)后病理檢查結(jié)果判斷頜頸部的淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。10 例正?？谇火つ?，取自口腔黏膜外傷組織。選取的106 例患者術(shù)前均未進行化學(xué)治療或放射治療，臨床分期按照TNM 國際統(tǒng)一分期方法(UICC)分組，其中Ⅰ期14 例，Ⅱ期為29 例，Ⅲ期38 例，Ⅳ期為25 例。組織病理學(xué)分級為：1 級33 例，2 級為51 例，3 級為22 例。具體腫瘤部位為：舌癌41例，牙齦癌為30 例，頰癌13 例，硬腭癌為8 例，口底癌14 例。免疫組化染色方法采用抗PCNA 和Survivin 單克隆抗體，分別對OSCC 切片染色。同時進行常規(guī)HE 染色。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 染色試劑DAB 由Sigma 公司提供，PCNA 及Survivin 單克隆抗體由武漢博士德公司提供。按照試劑說明以SABC免疫組織化學(xué)法常規(guī)操作。陽性對照分別用已知Survivin 及PCNA 陽性的乳腺癌切片作對照，陰性對照采取第一抗體用PBS 替代作對照，用DAB顯色，再用蘇木精復(fù)染。

1.3 Survivin 蛋白表達的判斷標(biāo)準(zhǔn) 腫瘤細胞質(zhì)內(nèi)含有棕褐色樣顆粒即視為陽性染色(圖1)。每張切片有10%以上的癌細胞表現(xiàn)為弱、中等著色強度[5]，即判斷為Survivin 表達陽性。

圖1 Survivin 陽性細胞漿內(nèi)含有棕色顆粒(免疫組化DAB 染色×400)

1.4 PCNA 標(biāo)記指數(shù)(PCNA Label index，PLI)的計算方法 腫瘤細胞核有棕褐色染色即視為PCNA染色陽性(圖2)。選取500 個腫瘤細胞計數(shù)其中PCNA 陽性細胞數(shù)量，其所占百分數(shù)則為PLI。

圖2 PCNA 陽性細胞核內(nèi)含有棕褐色顆粒(免疫組化DAB 染色×400)

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件包分析，Survivin 表達與PLI 和臨床因素關(guān)系的判斷使用卡方檢驗。P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 Survivin 的表達及PLI 檢測結(jié)果 74 例腫瘤組織Survivin 染色呈陽性，陽性率為69.81%。正常口腔黏膜組織中無表達，二者差異顯著(X2=19.28，P＜0.01)。PLI 值為16.1%～96.2%，平均值為(55.01±22.02)%，以PLI 平均值分為低56 例(16.1%～56.15%)、高50 例(56.15%～96.2%)兩組進行統(tǒng)計分析。

2.2 腫瘤組織中Survivin 蛋白表達與病理因素關(guān)系 Survivin 的蛋白表達量與OSCC 的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級和TNM 分期密切相關(guān)(P＜0.01)，見表1。

表1 Survivin 表達與臨床病理因素的關(guān)系(例數(shù))

2.3 腫瘤組織中Survivin 表達與PCNA 的關(guān)系 Survivin 表達陽性的口腔鱗狀細胞癌組，其PLI 值明顯高于Survivin 表達陰性組，兩者表達明顯正相關(guān)(P＜0.01)，結(jié)果見表2、圖3、圖4。

表2 Survivin 表達與PCNA 的關(guān)系

圖3 Survivin 表達與PLI 值高低線圖

圖4 Survivin 表達與PLI 值高低線圖

3.討論

在細胞的DNA 中，存在著凋亡基因及抑制凋亡基因，正常情況下，兩者處于平衡協(xié)調(diào)狀態(tài)，維護著細胞的生死秩序。目前發(fā)現(xiàn)的眾多凋亡抑制因子中，Survivin 是作用最強的因子，在人類所有腫瘤組織中，幾乎都發(fā)現(xiàn)了其表達，它可以抑制多種細胞凋亡基因誘導(dǎo)的腫瘤凋亡，通過抑制抗癌藥物的凋亡誘導(dǎo)，降低藥效[6]，且促使惡性腫瘤細胞的生長增殖。Survivin 在細胞增殖G2/ M 期選擇性表達，同時具有細胞周期的特異性，在細胞的有絲分裂期，紡錘軸的微管可以與Survivin 進行結(jié)合，而微管的運動又可以調(diào)節(jié)Survivin 的表達水平，Survivin 過度表達時，就很難與結(jié)合的微管分離，這時候就可以出現(xiàn)其持續(xù)的抗凋亡效果。由此認為在細胞G2/ M 期，Survivin 通過抑制凋亡誘導(dǎo)，促進細胞的異常生長增殖[7]。多項報道認為其可作為腫瘤預(yù)后不良的標(biāo)志[8-10]。

本結(jié)果表明，其Survivin 蛋白表達陽性率是69.81%，在高分化組是48.48%，而中低分化組高達79.45%，兩組之間差異顯著(P＜0.01)，說明隨著腫瘤分化程度降低，Survivin 的凋亡抑制作用更強，表達與病理分級相關(guān)。同時Survivin 表達和臨床分期也相關(guān)(P＜0.01)，在口腔鱗癌發(fā)病的后期其表達更強。本組Survivin 表達陽性患者，其頸部淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的機率大于陰性者(P＜0.01)，二者密切相關(guān)，同多數(shù)其他學(xué)者研究相似[11，12]。由此說明Survivin 的過高表達可以抑制細胞凋亡，促進腫瘤的無限制生長。腫瘤發(fā)生死亡的原因約85%～95%是其轉(zhuǎn)移引起[13]，臨床研究顯示口腔鱗癌晚期更易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，且與腫瘤的大小相關(guān)[14]。說明檢測口腔鱗癌Survivin 蛋白的表達對預(yù)后判斷有明顯指導(dǎo)作用，靶向Survivin 基因治療，將提供口腔癌治療的新途徑。

PCNA 蛋白的表達與細胞的生長增殖周期一致[15]，常作為細胞增殖生長活性的指標(biāo)[4，16]。已有多項臨床及動物實驗研究提示，PCNA 表達與口腔癌的病理分型和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[17，18]，可以作為其預(yù)后的指標(biāo)之一。本項研究表明在Survivin表達陽性者中，PLI 值明顯高于陰性者，差異顯著(P＜0.01)，兩者的表達明顯相關(guān)，說明Survivin蛋白一方面調(diào)控腫瘤凋亡，同時促進腫瘤增殖。目前口腔癌治療的最有效方法仍然是手術(shù)切除，本項研究提示腫瘤切除標(biāo)本若survivin 和PCNA 都陽性表達，表明預(yù)后不良，應(yīng)該進行術(shù)后放療和鞏固性治療，并且術(shù)后密切隨訪。手術(shù)前在進行腫物活檢時，建議同時進行survivin 和PCNA 檢測，陽性者應(yīng)考慮進行根治性切除。