張倩倩 劉麗駿 徐 盼 孫 陳 蔣偉文

正常人口腔黏膜角質(zhì)形成細(xì)胞(normal human oral keratinocytes，NHOKs)是口腔黏膜上皮重要組成細(xì)胞，發(fā)揮防御、感覺等功能。衰老過程中，黏膜結(jié)構(gòu)改變，功能受損，病變風(fēng)險(xiǎn)增加[1，2]。過量D-半乳糖(D-galactose，D-gal)能誘導(dǎo)細(xì)胞代謝發(fā)生改變，使活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)量增加，出現(xiàn)氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞損傷，發(fā)生衰老[3]。此時(shí)細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞周期抑制蛋白p53，p21 表達(dá)升高，衰老相關(guān)半乳糖苷酶活性升高[4，5]。Sirt1 是sirtuin 蛋白家族一員，是具有NAD+依賴的去乙酰化酶活性蛋白，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，衰老過程中表達(dá)下調(diào)，起到抗衰老作用[6，7]。D-gal 已被廣泛用于構(gòu)建多種器官組織衰老模型[8，9]，但在NHOKs 中的作用罕見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究D-gal 可否誘導(dǎo)NHOKs 衰老，探索其潛在作用機(jī)制為體外構(gòu)建口腔黏膜衰老模型提供理論依據(jù)，對(duì)研究口腔粘膜黏膜老化、治療口腔腫瘤疾病提供新的策略和思路。

1.材料與方法

1.1 主要材料 試劑主要試劑OKM 培養(yǎng)基(Sciencell)、DispaseⅡ中性蛋白酶(Roche)、鼠尾膠原、胰蛋白酶、青鏈霉素(Gibco)、磷酸鹽緩沖液PBS(Hyclone)、細(xì)胞角蛋白抗體PCK、細(xì)胞波形蛋白抗體Vimentin(Gene tech)、CCK-8 試劑盒(新賽美)、D-半乳糖(北京索萊寶)、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色試劑盒、RIPA 裂解液、ROS 檢測(cè)試劑盒(上海碧云天)、p53 抗體、p21 抗體、GAPDH 抗體、Actin 抗體(Cell Signaling)、sirt1抗體(SANTA CRUZ)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 (1)NHOKs 原代培養(yǎng)從18～60 歲因拔除阻生齒的健康患者處，獲得健康口腔黏膜組織。本研究通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)：滬九院倫審2018-63-T54 號(hào))?；颊呷朐\室后經(jīng)專人評(píng)估基本情況，符合要求者，征得其允許后，由醫(yī)生進(jìn)行口腔黏膜組織取材。取材部位靠近阻生齒，大小約5mm×5mm，避免過多過大取材對(duì)患者造成不必要的傷害。樣本取后立即保存于10%雙抗PBS 溶液中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，于無菌條件下去除組織下層多余的脂肪，用0.25%DispaseⅡ中性蛋白酶4℃過夜消化，分離上皮層，剪成約1mm3小塊，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 溶液于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中充分震蕩消化3min，離心，OKM 培養(yǎng)基重懸獲得單細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔三天換一次液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%傳代。本次研究使用P2 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(2)NHOKs 細(xì)胞鑒定將P2 代NKOKs 以1×105個(gè)/ mL 的密度接種于放置細(xì)胞爬片的24 孔板中，細(xì)胞達(dá)到70%時(shí)，用4%多聚甲醛固定爬片15min，PBS 洗三次。0.1%Triton-X 通透細(xì)胞30min，PBS 洗三次。于不同孔中分別滴加一抗角蛋白抗體和波形蛋白抗體，室溫孵育1h，PBS 洗三次。生物素標(biāo)記二抗室溫孵育半小時(shí)，PBS 洗三次。DAB 顯色2min，蘇木素復(fù)染2min，鹽酸脫水，清水沖洗晾干，中性樹膠封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察、攝取圖像。

1.3 CCK-8 檢測(cè) 細(xì)胞增殖活力將細(xì)胞懸液以5×104/ ml 密度種于96 孔板中，24h 后細(xì)胞貼壁，分別用0、10、20、40、80g/ L 的D-半乳糖處理細(xì)胞12h、24h、48h。0g/ L 作為對(duì)照組。每孔加入10ul CCK-8 溶液，37℃孵育4h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm 處吸光值，計(jì)算增殖活力。

1.4 β-半乳糖苷酶染色 使用衰老相關(guān)β 半乳糖苷酶染色試劑盒進(jìn)行衰老相關(guān)的β 半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase，SA-βgal)染色，檢測(cè)細(xì)胞衰老水平。在光學(xué)顯微鏡下攝取圖像，取三個(gè)視野，每個(gè)視野300 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算SA-β-gal 陽性細(xì)胞百分率。

1.5 ROS 含量檢測(cè) 將細(xì)胞懸液以5×104/ ml密度種于24 孔板中，24h 后細(xì)胞貼壁。20g/ L D-半乳糖作用細(xì)胞。分別于12h、24h、48h 時(shí)向每孔加入250μL 稀釋好的DCFH-DA，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20min。用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的探針。檢測(cè)488nm 激發(fā)波長，525nm 發(fā)射波長下的熒光值。

1.6 Western bolt 分析 細(xì)胞蛋白表達(dá)收集D-半乳糖處理過的NHOKs，RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 蛋白定量檢測(cè)樣品濃度，用5×蛋白上樣緩沖液將樣品稀釋至同一濃度，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)模至0.2μm 的PVDF，封閉液室溫封閉1h，目的蛋白一抗4℃孵育過夜，HRP 標(biāo)記的二抗于室溫孵育1h，使用ECL 顯影液于凝膠成像分析儀中采集信號(hào)，分析目的蛋白灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 所有計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，應(yīng)用Graphpad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)分析、作圖，采用單因素和多因素方差分析比較組間差異，P＜0.05 作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

2.結(jié)果

2.1 NHOKs 原代培養(yǎng)與細(xì)胞鑒定 細(xì)胞呈多邊形，邊界清楚，鋪路石狀，貼壁單層生長，肉眼見無混雜的成纖維細(xì)胞，符合NHOKs 形態(tài)學(xué)特征(圖1A)。角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性(圖1B)。波形蛋白染色成陰性(圖1C)。結(jié)果表明所培養(yǎng)的細(xì)胞特異性表達(dá)細(xì)胞角蛋白，但不表達(dá)波形蛋白，為角質(zhì)形成細(xì)胞，并且無成纖維細(xì)胞混雜。

圖1 NHOKs 細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞鑒定

2.2 D-半乳糖抑制細(xì)胞增殖活力 在NHOKs中加入0、10、20、40、80g/ L 的D-半乳糖，處理12h、24h、48h，結(jié)果顯示，D-半乳糖濃度越高，處理時(shí)間越長，細(xì)胞增殖活力越低(圖2)。與對(duì)照組相比，20g/ L、40g/ L 處理48h 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。80g/ L 處理12h、24h、48h，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。D-半乳糖抑制細(xì)胞增殖活力，具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性。選擇20g/ L 處理細(xì)胞48h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 D-半乳糖誘導(dǎo)NHOKs 發(fā)生衰老 D-半乳糖作用細(xì)胞后，SA-β-gal 陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖3A，B)。細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白p53 和p21 表達(dá)水平顯著升高(圖3C，D)。這些結(jié)果說明，D-半乳糖能夠誘導(dǎo)NHOKs 發(fā)生衰老。

圖2 D-半乳糖抑制NHOKs 增殖活力

圖3 D-半乳糖誘導(dǎo)NHOKs 發(fā)生衰老

2.4 D-半乳糖誘導(dǎo)NHOKs 衰老可能與氧化應(yīng)激有關(guān) 與對(duì)照組相比，20g/ L D-半乳糖分別作用NHOKs 的12h、24h、48h 后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平逐漸升高(圖4A)。48h 時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sirtuin-1(sirt1)是sirtuin 蛋白家族的一員，研究發(fā)現(xiàn)其與衰老過程的ROS 產(chǎn)生有關(guān)。本研究提取D-半乳糖處理了48h 的細(xì)胞蛋白，WB 結(jié)果顯示sirt1 表達(dá)顯著降低(圖4B，C)。因此，我們推測(cè)D-半乳糖誘導(dǎo)NHOKs 發(fā)生衰老可能與sirt1 相關(guān)的氧化應(yīng)激過程有關(guān)。

3.討論

圖4 D-半乳糖誘導(dǎo)NHOK 衰老可能與氧化應(yīng)激有關(guān)

口腔黏膜層起到防御、感覺、溫度調(diào)節(jié)和免疫等功能，角質(zhì)形成細(xì)胞廣泛存在于皮膚和黏膜表層，口腔黏膜的角質(zhì)形成細(xì)胞比皮膚具有更快的增殖、遷移能力[10]。口腔黏膜表面不斷受到各種機(jī)械、生物、化學(xué)刺激。并且菌群種類豐富，容易積累炎癥和免疫細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)。隨著年齡增長，口腔黏膜彈性纖維減少，膠原束增厚紊亂，黏膜彈性變差，且微血管減少，上皮厚度減少，不僅導(dǎo)致黏膜組織防御能力下降，創(chuàng)口愈合能力降低，感覺功能減退[11]，對(duì)老年人后期義齒修復(fù)也帶來諸多困難[12，13]。加上吸煙等環(huán)境因素的影響，口腔黏膜發(fā)生癌前病變和惡性病變的風(fēng)險(xiǎn)增加[1，2]。因此，體外構(gòu)建穩(wěn)定的口腔黏膜衰老模型對(duì)研究口腔黏膜衰老有重大意義。本研究首次證實(shí)，D-gal 可以在體外誘導(dǎo)NHOKs 發(fā)生衰老。

細(xì)胞衰老具有線粒體功能障礙、基因組不穩(wěn)定、衰老相關(guān)分泌表型、干細(xì)胞衰竭等表現(xiàn)等特征，主要機(jī)制包括ROS 產(chǎn)生、端粒酶縮短、線粒體損傷、細(xì)胞周期停滯等[5，14]。細(xì)胞衰老與線粒體功能障礙關(guān)系密切。當(dāng)細(xì)胞的線粒體功能損傷，發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量包括ROS 在內(nèi)的自由基，被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素[15]。多種上皮細(xì)胞的衰老研究證實(shí)衰老過程中p53-p21 信號(hào)通路激活[16]，且衰老過程中sirt1 表達(dá)顯著降低。Sirt1 與細(xì)胞早衰關(guān)系密切，被認(rèn)為是一種抗衰老因子[17]。參與應(yīng)激反應(yīng)、線粒體生物合成、增強(qiáng)代謝效率等[18]。

D-gal 是一種廣泛存在于乳制品、水果、蔬菜等食物中的單糖，可作為誘導(dǎo)衰老的人工老化藥物[19]。D-gal 誘導(dǎo)的老化垂體細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，p53，p21 蛋白表達(dá)增加，p53/ p21 通路被激活[20]。D-gal 誘導(dǎo)大鼠心臟衰老的模型中，也發(fā)現(xiàn)p53-p21 通路被激活，同時(shí)ROS 含量升高并加速衰老[21]。P53 是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA 修復(fù)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。P53激活可以誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯和調(diào)亡，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老和機(jī)體老化，對(duì)于腫瘤抑制和機(jī)體衰老至關(guān)重要[22]。P21 是DNA 損傷下p53 誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，導(dǎo)致細(xì)胞衰老的重要調(diào)節(jié)因子。P53-p21 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞衰老的經(jīng)典通路[5]。晶狀體上皮細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，d-gal 不但抑制增殖，還具有時(shí)間和濃度依賴性[23]。本次實(shí)驗(yàn)CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，20g/ L、40g/ L、80g/ L 濃度的D-gal 對(duì)NHOKs 增殖具有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越顯著。各個(gè)濃度組均顯示12h、24h、48h 細(xì)胞增殖活力逐漸降低，20g/ L 開始，差異開始顯著。因此我們認(rèn)為，D-gal抑制NHOKs 增殖，且具有濃度依賴和時(shí)間依賴性。我們通過WB 檢測(cè)20g/ L D-gal 誘導(dǎo)48h 的NHOKs 細(xì)胞周期相關(guān)通路蛋白p53 和p21 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)D-gal 處理后，蛋白表達(dá)均下調(diào)，說明細(xì)胞周期停止，增殖受到抑制，這與以往研究結(jié)果一致。

Sirt1 是NAD+依賴性去乙?；?，也是細(xì)胞能量代謝的感受器。通過p53、NICD、FOXO、NF-κB 等多種途徑調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮抗衰老作用[17]。NAD+/ NADH 比值增加從而激活sirt1。促進(jìn)線粒體蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子的活性，修復(fù)線粒體質(zhì)量，降低ROS 產(chǎn)生，延長細(xì)胞壽命[24]。衰老細(xì)胞sirt1 表達(dá)下降與這一機(jī)制相一致。過量D-gal 誘導(dǎo)可線粒體功能障礙，出現(xiàn)氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量ROS，損傷線粒體功能[19]。我們的數(shù)據(jù)顯示，20g/ L D-gal 誘導(dǎo)NHOKs 后，細(xì)胞ROS 含量隨時(shí)間延長而升高，48h 升高最顯著，此時(shí)sirt1 表達(dá)逐漸降低，48h 時(shí)達(dá)到最低。與上述研究一致。我們推測(cè)，D-gal 作用于NHOKs，線粒體功能出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致電子傳遞過程電子泄露，ROS 產(chǎn)生增加，且由于NADH 呼吸鏈?zhǔn)軗p，NADH 無法繼續(xù)向NAD+傳遞電子，NAD+含量下降，NAD+/ NADH 比值降低，sirt1 活性抑制，對(duì)ROS 的調(diào)控作用下降。因此ROS 呈上升趨勢(shì)。

綜上所述，本研究證明D-gal 可在體外誘導(dǎo)NHOKs 發(fā)生早衰，這一過程可能與sirt1 參與調(diào)控的氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。這一結(jié)論為體外構(gòu)建口腔黏膜衰老模型提供依據(jù)，但尚需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為研究口腔黏膜老化提供更多工具。