方首镕 王曉云 蔣寧寧 孫立平

口腔鱗狀細(xì)胞癌簡稱口腔鱗癌，是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，癌細(xì)胞的增殖活力強(qiáng)、惡性程度高，治療后的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率均較高，5 年生存率不足50%[1，2]。目前，口腔鱗癌的發(fā)病機(jī)制未闡明，臨床上也缺乏靶向治療口腔鱗癌的手段。因此，研究口腔鱗癌的發(fā)病機(jī)制、尋找靶向癌細(xì)胞增殖的精確治療靶點具有十分重要意義。

微小RNA(microRNA，miR)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有廣泛生物學(xué)作用的非編碼小分子RNA，多種miR 在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中通過靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲來起到促癌或抑癌作用。miR-375 是一種具有抑癌作用的miR，在前列腺癌、食管癌、直腸癌、口腔鱗癌中的表達(dá)均明顯減少[3-6]，提示增加miR-375 表達(dá)可能是潛在的抗癌靶點。前列腺癌相關(guān)的細(xì)胞實驗證實，miR-375 對細(xì)胞周期蛋白D2(cyclinD2)的表達(dá)具有抑制作用[7]；在targetscan 網(wǎng)站進(jìn)行生物信息學(xué)分析可知，cyclinD2 基因mRNA 的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)中有miR-375 的結(jié)合靶點。基于此提出假設(shè)：miR-375能夠在口腔鱗癌中靶向cyclinD2 并調(diào)節(jié)細(xì)胞的惡性生物學(xué)特征。為了驗證這一假設(shè)，本實驗以口腔鱗癌細(xì)胞株CAL27 為實驗對象，具體分析了miR-375 靶向cyclin D2 調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡的作用。

1.材料與方法

1.1 細(xì)胞 口腔鱗癌細(xì)胞株CAL27(ATCC 公司，美國)，液氮中冷凍保存。

1.2 試劑 陰性對照(NC)mimic、miR-375 mimic、NC siRNA、cyclinD2 siRNA(上海吉瑪公司，中國)，表達(dá)cyclinD2 的pcDNA3.1 質(zhì)粒及空白的pcDNA3.1 質(zhì)粒(上海生工公司，中國)，miRNA 專用的提取分離試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測試劑盒(北京天根公司，中國)，MTS 細(xì)胞增殖活力檢測試劑盒及Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京全式金公司，中國)，cyclinD2 的單克隆一抗(Abcam 公司，美國)。

1.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司，美國)，凝膠成像儀及熒光定量PCR 儀(Bio-rad 公司，美國)，顯微鏡(Olympus 公司，日本)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組干預(yù) CAL27 在含有10%胎牛血清的DMEM 中培養(yǎng)，0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代，取傳代后對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行分組，方法如下：(1)對照組用不含脂質(zhì)體的DMEM干預(yù)；(2)NC mimic 組用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NC mimic；(3)miR-375 mimic 組用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-375 mimic；(4)NC siRNA 組用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NC siRNA；(5)cyclinD2 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染cyclinD2 siRNA；(6)空白質(zhì)粒+miR-375 mimic 組用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染空白的pcDNA3.1 質(zhì)粒及miR-375 mimic；(7)cyclinD2 質(zhì)粒+miR-375 mimic 組用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染表達(dá)cyclinD的pcDNA3.1 質(zhì)粒及miR-375 mimic。每組設(shè)置5 個復(fù)孔，連續(xù)干預(yù)24 小時。

1.4.2 細(xì)胞增殖活力的檢測 傳代的CAL27細(xì)胞調(diào)節(jié)至細(xì)胞密度為3×104/ mL，按照每孔200μL 接種在96 孔培養(yǎng)板內(nèi)并按1.4.1 的方法進(jìn)行分組干預(yù)，24 小時后按照MTS 細(xì)胞增殖活力檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作，檢測細(xì)胞在490nm波長處的細(xì)胞中，記錄為OD490，OD490 越高、細(xì)胞增殖活力越強(qiáng)。

1.4.3 細(xì)胞凋亡的檢測 傳代的CAL27 細(xì)胞調(diào)節(jié)至細(xì)胞密度為3×104/ mL，按照每孔500μL接種在24 孔培養(yǎng)板內(nèi)并按1.4.1 的方法進(jìn)行分組干預(yù)，24 小時后消化收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明書進(jìn)行染色操作，染色后在流式細(xì)胞儀上計計算Annexin V 陽性且FITC陰性的細(xì)胞比例，即為凋亡率。

1.4.4 miR-375 表達(dá)的檢測 傳代的CAL27細(xì)胞接種在12 孔培養(yǎng)板內(nèi)并按1.4.1 的方法進(jìn)行分組干預(yù)，24 小時后棄去培養(yǎng)基、保留細(xì)胞，采用miRNA 專用的提取試劑盒提取細(xì)胞中的miRNA，采用cDNA 第一鏈合成試劑盒將細(xì)胞中的miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用熒光定量PCR 檢測試劑盒對cDNA 中的miR-375 及U6 進(jìn)行擴(kuò)增，軟件中自動生成循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，根據(jù)Ct 計算miR-375 的表達(dá)水平。

1.4.5 cyclinD2 表達(dá)的檢測 傳代的CAL27細(xì)胞調(diào)節(jié)至細(xì)胞密度為3×104/ mL，按照每孔1.0mL 接種在12 孔培養(yǎng)板內(nèi)并按1.4.1 的方法進(jìn)行分組干預(yù)，24 小時后棄去培養(yǎng)基、保留細(xì)胞，用RIPA 裂解液提取細(xì)胞中的蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白含量，取含有30μg 蛋白的樣本進(jìn)行western blot，將樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，電泳后電轉(zhuǎn)膜NC 后，將NC 膜放入5%脫脂牛奶中、室溫封閉1 小時，而后將NC 膜放入1∶1000 稀釋的cyclinD2 一抗或1∶5000 稀釋的β-actin 一抗中、4℃孵育過夜；第二天，將NC 膜放入1∶2000稀釋的HRP 二抗中、室溫孵育1 小時，最后在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值、以β-actin 為內(nèi)參計算cyclinD2 的表達(dá)水平。

1.2.6 miR-375 靶向cyclinD2 的生物信息學(xué)分析 在targetscan 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行生物信息學(xué)分析，輸入miR-375 后得到靶基因列表，分析cyclinD2 基因mRNA 3’UTR 中與miR-375 結(jié)合的位點及堿基。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測 構(gòu)建包含cyclinD2 基因mRNA 3’UTR 的雙熒光素酶報告基因，先將雙熒光素酶報告基因用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，而后按照NC mimic 組和miR-375 mimic組的干預(yù)方法分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NC mimic 或miR-375 mimic，24 小時后收集細(xì)胞并用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定螢火蟲熒光值和海腎熒光值，計算螢火蟲熒光值/ 海腎熒光值，以此反映雙熒光素酶報告基因的熒光活性。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0 軟件錄入數(shù)據(jù)，三組間計量資料的比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 過表達(dá)miR-375 對CAL27 細(xì)胞增殖及凋亡的影響 與對照組、NC mimic 組比較，miR-375 mimic 組細(xì)胞中miR-375 的表達(dá)水平及凋亡率均明顯增加，增殖活力OD490 水平明顯降低(P＜0.05)，見圖1。

2.2 過表達(dá)miR-375 對CAL27 細(xì)胞中cyclin D2 的靶向調(diào)節(jié) 經(jīng)Targetscan 進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測，miR-375 能夠靶向cyclinD2 mRNA 3’UTR；與對照組、NC mimic 組比較，miR-375 mimic 組細(xì)胞中cyclinD2 的表達(dá)水平、熒光素酶報告基因的熒光活力明顯降低(P＜0.05)，見圖2。

圖1 三組間miR-375 表達(dá)、OD490 水平、凋亡率的比較

圖2 三組間cyclin D2 表達(dá)、熒光素酶報告基因活力的比較

2.3 敲低cyclinD2 對CAL27 細(xì)胞增殖及凋亡的影響 與對照組及NC siRNA 組比較，cyclinD2 siRNA 組細(xì)胞中cyclinD2 的表達(dá)水平及增殖活力OD490 水平明顯降低，凋亡率均明顯增加(P＜0.05)，見圖3。

2.4 過表達(dá)cyclinD2 對miR-375 調(diào)節(jié)CAL27細(xì)胞增殖及凋亡的影響 與空白質(zhì)粒組比較，空白質(zhì)粒+miR-375 mimic 組細(xì)胞中cyclinD2 的表達(dá)水平及增殖活力OD490 水平明顯降低，凋亡率均明顯增加(P＜0.05)，見圖4。

3.討論

癌細(xì)胞增殖及凋亡異常是口腔鱗癌重要的惡性生物學(xué)特征，研究口腔鱗癌細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控機(jī)制有助于深入認(rèn)識口腔鱗癌的發(fā)病機(jī)制。近年來，多種miR 被證實在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到促癌或抑癌作用，相應(yīng)的在惡性腫瘤病灶中發(fā)生了高表達(dá)或低表達(dá)。miR-375 是在多種惡性腫瘤病灶中表達(dá)減少的一種具有抑癌作用的miR，多項細(xì)胞實驗證實，miR-375 對結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、胃癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用、凋亡具有促進(jìn)作用[8-10]。在口腔鱗癌患者的唾液中，miR-375 的表達(dá)明顯降低[6]，但miR-375 對口腔鱗癌細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控作用及機(jī)制仍未闡明。因此，本實驗將以口腔鱗癌細(xì)胞CAL27 為對象、通過分析miR-375 對癌細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控作用及機(jī)制來闡明miR-375 在口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用。

圖3 三組間cyclinD2 表達(dá)、OD490 水平、凋亡率的比較

圖4 三組間cyclinD2 表達(dá)、OD490 水平、凋亡率的比較

在本實驗中，將miR-375 mimic 轉(zhuǎn)染進(jìn)入CAL27 細(xì)胞后、細(xì)胞中miR-375 的表達(dá)明顯增多；在過表達(dá)miR-375 后，CAL27 細(xì)胞的增殖活力下降、凋亡率增加，說明miR-375 對CAL27 的增殖具有抑制作用、凋亡具有促進(jìn)作用，這一生物學(xué)作用與miR-375 在口腔鱗癌患者唾液中表達(dá)降低的現(xiàn)象吻合。MiR 生物學(xué)作用的實現(xiàn)依賴與靶向結(jié)合靶基因mRNA 的3’UTR 后對基因表達(dá)的抑制，本實驗在targetscan 網(wǎng)站中對miR-375 進(jìn)行了生物信息學(xué)分析并發(fā)現(xiàn)促增殖基因cyclinD2的3’UTR 上有miR-375 的結(jié)合靶點，轉(zhuǎn)染miR-375 mimic 后，CAL27 細(xì)胞中cyclinD2 的表達(dá)減少、含有CAL27 細(xì)胞基因3’UTR 的雙熒光素酶報告基因的熒光值明顯下降，說明cyclinD2 是miR-375 的靶基因，miR-375 靶向抑制cyclinD2的表達(dá)與其抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)。

CyclinD2 是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的蛋白，與細(xì)胞周期蛋白激酶形成復(fù)合體后能夠加速細(xì)胞周期，進(jìn)而使細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡受阻。多種因子被證實能夠通過改變cyclinD2 的表達(dá)來調(diào)節(jié)口腔鱗癌細(xì)胞的增殖及凋亡[11，12]。本實驗的結(jié)果已經(jīng)證實miR-375 能夠靶向抑制cyclinD2 的表達(dá)，進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染cyclinD2 siRNA 的方式來敲低cyclinD2 的表達(dá)并驗證CAL27 細(xì)胞中cyclinD2 表達(dá)下調(diào)的生物學(xué)效應(yīng)。在敲低cyclinD2 的表達(dá)后，CAL27 細(xì)胞的增殖活力減弱、凋亡率增加，說明miR-375 引起的cyclinD2 表達(dá)減弱具有抑制增殖、促進(jìn)凋亡的效應(yīng)。為了進(jìn)一步驗證miR-375 通過靶向cyclinD2 來調(diào)節(jié)CAL27 細(xì)胞的增殖和凋亡，本實驗還設(shè)計了過表達(dá)cyclinD2 的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒使細(xì)胞中的cyclinD2 發(fā)生過表達(dá)后，miR-375 抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，說明cyclinD2 表達(dá)減少介導(dǎo)了miR-375 抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，miR-375 對口腔鱗癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用、凋亡具有促進(jìn)作用且靶向抑制cyclinD2 是介導(dǎo)該作用的分子機(jī)制之一，未來miR-375 可以作為治療口腔鱗癌的靶點，但miR-375對口腔鱗癌的治療價值仍需進(jìn)一步深入的研究。