王飛 陸瑞敏 王淑艷 王夢薇 張迪 王啟航 李麗娜 陳萌

Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of cajal，ICC)介于腸神經(jīng)系統(tǒng)和平滑肌細(xì)胞之間的“起搏細(xì)胞”，參與胃腸動力的調(diào)節(jié)[1]。實驗表明，許多胃腸動力障礙性疾病都伴隨著ICC數(shù)量減少或網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞[2]，同時ICC數(shù)量減少或結(jié)構(gòu)異常也會引發(fā)胃腸功能障礙疾病[3]。目前，關(guān)于胃腸動力障礙疾病，治療手段單一，“心下痞”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)胃腸功能障礙之病狀十分相似[4]，而半夏瀉心湯為醫(yī)治“心下痞”的經(jīng)方，臨床效果顯著。已有研究表明，ICC受炎癥、氧化應(yīng)激、梗阻等影響，可導(dǎo)致“典型”的表型喪失，但其表型具有可塑性[5]。因此，本研究從細(xì)胞分子角度入手，觀察半夏瀉心湯對ICC表型維持蛋白及其相關(guān)鈣離子通道蛋白的影響，探索半夏瀉心湯治療胃腸動力障礙性疾病的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與動物

新生小鼠原代胃cajal間質(zhì)細(xì)胞(拓普生物，批號：TOPCP1024)；清潔級雄性SD大鼠30只，體重(200±20)g，購于斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0002。常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院清潔級動物房。

1.2 藥物與試劑

半夏瀉心湯中藥免煎顆粒購于北京康仁堂藥業(yè)有限公司；兔抗c-Kit多克隆抗體(批號：D13A2)、山羊抗兔488標(biāo)記熒光二抗(批號：A23220)購自美國Cell Signaling公司；c-Kit Antibody(批號：SC-365504)購自美國Santa公司；Desmin antibody(批號：16520-1-AP)購自中國proteintech公司；SMMHC antibody(批號：ab125884)、α-SMA antibody(批號：ab5694)購自美國Abcam公司；Dylighe 549, Goat Anti-Rabbit IgG(批號：A23320)、Dylighe 649,Goat Anti-Mouse IgG(批號：A23610)購自美國Abbkine公司；Total RNA Extraction Kit(批號：GPQ1801)、mRNA cDNA Synthesis Kit(批號：GPQ1803)、mRNA/lncRNA qPCR Kit(批號：GPQ1808)、Protein Extraction Kit(批號：GPP1815)、SDS-PAGE Gel Kit(批號：GPP1816)、ECL Plus Western Blot Kit(批號：GPP1824)均購自北京GenePool公司。

1.3 設(shè)備儀器

TCS-SP8型萊卡激光共聚焦顯微鏡(日本SANYO公司)、NANODROP 2000型分光光度計(美國Thermo scientific)、Line Gene 9600 Plus型熒光定量PCR儀(杭州Bioer Technology)、MP-8001型雙垂直電泳槽、MP-3030型轉(zhuǎn)移槽、PP-1150型電泳儀(北京CAVOY公司)。

1.4 藥物血清制備

半夏瀉心湯生藥比例按原著換算[6]，并按照人的單位體重生藥量進行換算求得大鼠單位體重的生藥量，具體如下：半夏14 g，炙甘草、黃芩、干姜、黨參各15 g，大棗10 g，黃連5 g。按生藥量換算成免煎顆粒。30只SD大鼠常規(guī)條件喂養(yǎng)3天，隨機分為半夏瀉心湯組和對照組。分別給予半夏瀉心湯和去離子水灌胃，劑量為5 mL/(kg·d)，連續(xù)7天。末次給藥2小時后，腹主動脈無菌取血，離心取血清。

1.5 細(xì)胞分組及干預(yù)

ICC細(xì)胞復(fù)蘇傳至3代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以3×104個/皿的濃度接種于3.5 cm激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育36小時，鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)是否穩(wěn)定，并隨機標(biāo)記分為空白組、對照組(10%去離子水大鼠血清)、低濃度組(5%半夏瀉心湯藥物血清)、中濃度組(10%半夏瀉心湯藥物血清)、高濃度組(20%半夏瀉心湯藥物血清)。每組各設(shè)6個復(fù)孔，給予相應(yīng)藥物干預(yù)后，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12小時、24小時和48小時。

1.6 激光共聚焦顯微鏡觀察ICC表型維持的情況

分別于12小時、24小時和48小時，漂洗、固定、透膜處理后，加入5%正常山羊血清37℃封閉60 分鐘。按順序加入一抗4℃冰箱過夜，二抗室溫孵育60分鐘。漂洗后，加入DAPI染細(xì)胞核室溫孵育10分鐘。PBS洗三遍，每孔加入0.5 mL PBS，在激光共聚焦顯微鏡相同設(shè)置下進行檢測，應(yīng)用Image Pro Plus V6.0專用圖片分析軟件，測定陽性反應(yīng)熒光的灰度值。比較三組與對照組灰度值差異。

1.7 Western Blot法檢測鈣離子通道蛋白IP3R、RyR、PLC的表達(dá)

取3代對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105/孔的密度接種于6孔板中，隨機分為空白組、對照組、藥物組(20%，12 h)，每組3個復(fù)孔。按照Protein Extraction Kit說明書操作，提取細(xì)胞總蛋白。BCA法蛋白定量，100 ℃×10 min蛋白變性。取50μg樣品進行電泳，轉(zhuǎn)膜，4℃過夜。按說明書加入一抗、二抗，加入ECL顯色液，避光反應(yīng)1 min，暗室曝光、顯影并定影。以β-actin為內(nèi)參照。各條帶灰度值采用Quantity One V.4.6.2軟件進行分析，目的蛋白/β-actin即為該蛋白的相對表達(dá)量。比較藥物組與對照組三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-triphosphate receptors,IP3R)、蘭尼堿受體(ryanodine receptor,RyR)、磷脂酶C(phospholipases C,PLC)蛋白表達(dá)差異。

1.8 實時熒光定量PCR法檢測鈣離子通道蛋白IP3R、RyR、PLC mRNA的表達(dá)

收集細(xì)胞，按照Total RNA Extraction Kit說明書提取總RNA，并電泳檢測完整性。根據(jù)mRNA cDNA Synthesis Kit說明書進行反轉(zhuǎn)錄，cDNA -20℃保存。按照mRNA/lncRNA qPCR Kit說明書進行擴增，擴增程序為：95℃ 30秒，(95℃ 5秒，60℃ 30秒)×45個循環(huán), 以β-actin為內(nèi)參，所得CT值按照2-△△CT的方法進行均一化處理后再進行統(tǒng)計學(xué)分析。比較藥物組與對照組IP3R、RyR、PLC mRNA表達(dá)差異。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各濃度半夏瀉心湯藥物血清對ICC表型維持的影響

在激光共聚焦顯微鏡下，c-kit免疫熒光染色陽性細(xì)胞呈綠色，主要集中于細(xì)胞膜上。α-SMA、desmin和SMMHC陽性反應(yīng)呈現(xiàn)紅色，主要構(gòu)成平滑肌細(xì)胞骨架(見圖1～3)。空白組和對照組相比，ICC c-kit、α-SMA、desmin和SMMHC表達(dá)無差異(P>0.05)，即去離子水藥物血清對ICC表型維持無影響。

圖1 c-kit/α-SMA免疫熒光雙標(biāo)記圖

從用藥濃度上分析，與對照組比較，中濃度組與高濃度組 c-kit陽性表達(dá)顯著增加，同時α-SMA陽性表達(dá)減少，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，高濃度組α-SMA表達(dá)下降明顯(P<0.01)且SMMHC表達(dá)、desmin表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與高濃度組比較，中濃度組SMMHC表達(dá)和desmin表達(dá)明顯表達(dá)增加，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，說明ICC平滑肌型增多。故高濃度組ICC表型維持明顯，即20%半夏瀉心湯全方的SD大鼠含藥血清培養(yǎng)有利于ICC表型維持。見表2。

表2 各濃度半夏瀉心湯藥物血清對ICC c-kit/α-SMA、c-kit/desmin和c-kit/SMMHC表達(dá)的影響(平均灰度值,

圖2 c-kit/desmin免疫熒光雙標(biāo)記

圖3 c-kit/SMMHC免疫熒光雙標(biāo)記圖

從處理時間分析，與24小時組、48小時組比較，12小時組c-kit陽性表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，α-SMA、desmin和SMMHC表達(dá)有減少趨勢。與48小時組比較，12小時組α-SMA平均灰度值明顯降低(P<0.05)。與24小時相比，12小時組α-SMA、desmin和SMMHC平均灰度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。綜上，12小時組ICC表型明顯維持，即藥物干預(yù)后，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12小時有利于ICC表型的維持。見表3。

表3 各處理時間對ICC c-kit/α-SMA、c-kit/desmin和c-kit/SMMHC表達(dá)的影響(平均灰度值,

2.2 各組小鼠Cajal間質(zhì)細(xì)胞鈣離子通道IP3R、RyR、PLC蛋白表達(dá)的比較

與空白組相比，對照組IP3R、PLC與空白相比無明顯變化(P>0.05)，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，RyR表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與空白組相比，藥物組IP3R、RyR、PLC的蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較，藥物組IP3R、RyR、PLC的蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4、表4。

表4 各組小鼠cajal間質(zhì)細(xì)胞鈣離子通道IP3R、RyR、PLC蛋白表達(dá)的比較

圖4 各組小鼠cajal間質(zhì)細(xì)胞鈣離子通道IP3R、RyR、PLC蛋白表達(dá)的比較

2.3 各組小鼠Cajal間質(zhì)細(xì)胞ICC鈣離子通道IP3R、RyR、PLC mRNA表達(dá)的比較

與空白組相比， IP3R mRNA、RyR mRNA、PLC mRNA表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，與空白組相比，藥物組IP3R mRNA、RyR mRNA、PLC mRNA的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，藥物組IP3R mRNA、RyR mRNA、PLC mRNA表達(dá)均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組小鼠cajal間質(zhì)細(xì)胞ICC鈣離子通道IP3R、RyR、PLC mRNA表達(dá)的比較

3 討論

ICC普遍分布于胃腸道，與腸神經(jīng)系統(tǒng)和平滑肌形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對起搏功能至關(guān)重要。c-kit信號傳導(dǎo)對ICC表型維持至關(guān)重要，當(dāng)c-kit被阻斷時，ICC不發(fā)生細(xì)胞凋亡，而開始分化，可分化為平滑肌表型[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，原位及新分離培養(yǎng)的ICC不表達(dá)肌球蛋白，但在培養(yǎng)過程中逐漸表達(dá)，呈平滑肌表型[9]。α-肌動蛋白(smooth muscle α-actin，α-SMA)和平滑肌肌球蛋白重鏈(smooth muscle myosin heavy chain，SMMHC)主要分布于較成熟的平滑肌細(xì)胞中，反映平滑肌細(xì)胞的收縮能力的強弱，其中，α-SMA在未分化的平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells，SMC)中含量極少，而在分化狀態(tài)的SMC中呈大量表達(dá)，且在分化早期表達(dá)，其含量增高是SMC分化成熟的標(biāo)志[10]。desmin是一種在肌細(xì)胞細(xì)胞骨架的中間細(xì)絲中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)[11]，最早表達(dá)于未分化的肌母細(xì)胞中的肌源性蛋白，是肌分化的早期標(biāo)志，但有些SMC不含有desmin[12]。從平滑肌相關(guān)蛋白的表達(dá)，可推測細(xì)胞是否產(chǎn)生表型的轉(zhuǎn)化。本研究經(jīng)免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)，以高濃度藥物血清干預(yù)12小時的的ICC表型維持明顯(P<0.05)，ICC c-kit 陽性表達(dá)顯著增加，c-kit/α-SMA陽性表達(dá)明顯減少，推測半夏瀉心湯可增強ICC表型的維持，減少ICC向平滑肌的轉(zhuǎn)化。

ICC Ca2+調(diào)節(jié)的機制是胃腸運動模式的基礎(chǔ)，其慢波的形成依就于ICC中Ca2+激活的Cl-通道(ANO1)的激活[13]。Ca2+瞬變是由細(xì)胞內(nèi)儲存的Ca2+釋放引起的，并且依賴于RyR(蘭尼堿受體)以及來自IP3受體的擴增。最開始由細(xì)胞外配體與胞膜酪氨酸激酶受體結(jié)合，PLC(激活磷脂酶 C)產(chǎn)生IP3，結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3R，IP3R被認(rèn)為是負(fù)責(zé)通過細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放產(chǎn)生自發(fā)內(nèi)向電流的關(guān)鍵受體[14]。在鈣儲存中除了IP3R，還有一個主要受體RyR，它們的結(jié)構(gòu)和功能比較相似。而RyR敏感的鈣庫在胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高的條件下，引發(fā)Ca2+的釋放,這時RyR即隨著鈣庫鈣的釋放，打開細(xì)胞膜上操縱Ca2+的通道，引起Ca2+內(nèi)流，促進細(xì)胞外Ca2+向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移[15]。有實驗研究了IP3R、RyR、PLC受抑制會降低鈣震蕩的頻率。其中，IP3R受體表達(dá)被抑制的小鼠不表現(xiàn)出慢波活動[16-17]。鈣離子通道蛋白對細(xì)胞增殖、凋亡、表型維持有強烈調(diào)控作用，ICC表型的維持依賴于細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的動態(tài)調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，鈣離子相關(guān)通道可維持主動脈平滑肌細(xì)胞，抑制其向成骨或成軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[18]。本實驗經(jīng)Western Blot法、RT-PCR法，從蛋白和基因表達(dá)角度，證明半夏瀉心湯可增強鈣離子通道相關(guān)蛋白IP3R、RyR、PLC的表達(dá)。

目前，胃腸動力障礙原因多集中體現(xiàn)于ICC凋亡或表型轉(zhuǎn)化兩方面[19]?；谛南缕M與胃腸運動功能紊亂之間的密切聯(lián)系，半夏瀉心湯為治療“心下痞”的經(jīng)典方劑，可較好調(diào)節(jié)胃腸道的運動能力。本研究證明，半夏瀉心湯可顯著增強ICC的表型維持，加強c-kit表達(dá)，其機理可能是通過調(diào)節(jié)鈣庫受體蛋白IP3R、RyR、PLC表達(dá)水平，影響相關(guān)離子通道，以產(chǎn)生節(jié)律性收縮，促使胃腸道動力恢復(fù)正常。這種機制可能是該方調(diào)節(jié)胃腸運動、治療“心下痞”的機制之一。