鞏卓彥 吳藝瓊 黃帥陽 劉珍洪 秦高鳳 王蓬文

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)起病隱匿并呈進行性發(fā)展趨勢，主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知、生活及行為功能障礙，病變累及多個系統(tǒng)。突觸信號傳遞蛋白在神經(jīng)信號的正常傳遞方面起到重要影響作用，其功能的缺失會進一步改變認(rèn)知能力[1]。AD所發(fā)生的某些病理改變與谷氨酸受體缺陷有關(guān)[2]，其亞型代謝性谷氨酸受體5 (metabotropic glutamate receptors5, mGluR5)是突觸后膜介導(dǎo)Aβ寡聚體(A beta oligomers, Aβo )產(chǎn)生細胞毒性，破壞突觸正常傳遞功能并產(chǎn)生認(rèn)知障礙的必要受體蛋白。研究膽堿能信號蛋白在突觸中的變化可以幫助進一步認(rèn)識AD[3]。煙堿型乙酰膽堿受體家族中的α7尼古丁乙酰膽堿受體(α7-nicotinic acetylcholine receptors,α7-nAChRs)位于突觸前膜和后膜，前膜的α7-nAChRs調(diào)控釋放神經(jīng)遞質(zhì)，后膜的α7-nAChRs在包括主導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶功能的海馬在內(nèi)的多個腦區(qū)域調(diào)控突觸可塑性。突觸是AD病理變化出現(xiàn)的最早部位，在Aβ影響下其功能發(fā)生了改變，研究突觸的改變不僅能夠認(rèn)識早期AD病理變化，而且可以幫助尋找治療AD的有效靶標(biāo)。

中藥復(fù)方金思維是一種自草藥提取的混合物，由田金洲教授研究團隊在中國工程院院士王永炎教授指導(dǎo)下研制而成，其中包括由人參中的人參皂苷，來自菖蒲的細辛醇，遠志的細葉遠志皂苷，來自淫羊藿的黃酮苷，郁金中的姜黃素等八種有效成分[4-5]。輕度認(rèn)知功能障礙是AD前認(rèn)知功能的中間狀態(tài)，中藥復(fù)方金思維能夠顯著改善遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙患者的認(rèn)知功能[6]；研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方金思維能通過抑制APPV717I小鼠腦內(nèi)早老素1活性和促進胰島素降解酶和腦啡肽酶活性來降低Aβ水平[7]；有研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方金思維能通過增加AD模型大鼠海馬區(qū)GAP-43表達影響突觸可塑性[8]。然而，尚不清楚早期突觸傳遞和突觸功能障礙在中藥復(fù)方金思維改善早期認(rèn)知損害中是否發(fā)揮重要作用，因此研究旨在通過觀察中藥復(fù)方金思維干預(yù)下擬散發(fā)性AD小鼠腦內(nèi)突觸蛋白α7-nAChRs和mGluR5的表達變化，探討中藥復(fù)方金思維對AD病理變化中突觸傳遞和功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及設(shè)備

復(fù)方金思維為專利制劑[9](專利號：2008100067330)(藥物組成：人參、肉蓯蓉、地黃、茯苓、石菖蒲、郁金、丹參和遠志)，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院藥房制備；鹽酸多奈哌齊購自衛(wèi)材(中國)藥品有限公司，藥品批號：140625；羥甲基纖維素鈉由北京精求化工有限公司提供，批號：3405005；2.5%戊二醛和0.1MPB緩沖液購自北京陸軍總醫(yī)院；叔戊醇和多聚甲醛由北京化學(xué)試劑公司提供；一抗兔抗小鼠α7-AchR抗體(免疫組化抗體滴度1∶200)和mGluR5抗體 (免疫組化抗體滴度1∶500，Western blot抗體滴度1∶7500)由Abcam公司提供；Western-blot所用RIPA裂解液，批號：R0010；1M、1.5M Tris-HCL緩沖液，批號：A1010，T1020；SDS溶液，SDS-PAGE凝膠配置試劑盒，鏈脲佐菌素(Sigma)均由北京索萊寶科技有限公司提供；免疫組化所用檸檬酸鹽，貨號：ZLI：9064，RT；PBS緩沖液粉劑，貨號：9061；兔二步法試劑盒，貨號：PV-9001；小鼠二步法試劑盒，貨號：PV-9002，均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；Morris水迷宮測試及相關(guān)分析儀器購自上海移數(shù)信息科技有限公司；JEM-2100F型透射電鏡來自日本日立電子公司。

1.2 動物

實驗動物來自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號(京)：2012-0001]。雄性3月齡C57/BL6J小鼠，共計90只。由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障環(huán)境動物室[實驗動物使用許可證號(京)：2015-0001]負(fù)責(zé)飼養(yǎng)，每日按時灌胃，小鼠自由飲水進食，定期更換墊料。本研究所用實驗動物經(jīng)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動物倫理委員會準(zhǔn)許(倫理編號：16-13)。

1.3 動物分組及給藥

將90只C57/BL6J小鼠隨機分為6組(每組15只)：對照組、模型組、多奈哌齊組[0.92 mg/(kg·d)]及復(fù)方金思維大、中、小劑量組[20 mg/(kg·d)，10 mg/(kg·d)，5 mg/(kg·d)]。第1和第3天進行雙側(cè)側(cè)腦室造模：用叔戊醇對小鼠進行麻醉，剪掉頭頂上的毛發(fā)并用酒精消毒，沿中線剪開小鼠頭皮并暴露前囟，以前囟旁側(cè)1.0 mm和后側(cè)0.3 mm為坐標(biāo)，向下進針2.5 mm，利用微量注射器注入3 μL液體。除對照組其余5組小鼠按照3 mg/kg濃度注射鏈脲佐菌素(Streptozocin, STZ)，對照組小鼠按照相同方法雙側(cè)側(cè)腦室注射等量生理鹽水[10-12]。造模1個月后給藥，每日定時灌胃，持續(xù)3個月。

1.4 Morris水迷宮測試

Morris水迷宮實驗中，第1天和第2天為訓(xùn)練階段，第3天至第5天為測試階段，本次實驗旨在測試小鼠在訓(xùn)練階段定位航行潛伏期的時間。

1.5 透視電鏡觀察

Morris水迷宮實驗結(jié)束，對小鼠(3只/組)進行灌注固定，斷頸，在冰上迅速剝離海馬，用2.5%戊二醛溶液進行固定，4℃靜置2小時，用PBS緩沖液沖洗3次。將海馬組織制成超薄切片，在×7000倍數(shù)視野下觀察小鼠海馬CA1區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)，并對突觸的形態(tài)學(xué)變化進行分析。

1.6 Western blot檢測

Morris水迷宮實驗結(jié)束，對小鼠(6只/組)進行麻醉并進行斷頸處死，迅速取出海馬并置于EP管中并在液氮罐中保存。對組織進行蛋白提取并對其濃度進行測定；配膠并上樣；電泳跑濃縮膠時用60 V，使樣品壓成一條線，跑到分離膠以后用120 V跑，根據(jù)所要檢測的蛋白分子量大小來決定最終電泳停止的時間；轉(zhuǎn)膜后進行雜交，做雜交前應(yīng)先進行膜封閉，然后進行抗體孵育；使用HRP-ECL發(fā)光法進行發(fā)光鑒定；用Hp Scanjet G4050儀器進行掃描并保存為TIF格式，并基于 Image J、Excel 軟件對其進行分析，得到相對百分?jǐn)?shù)結(jié)果，基于 Prism 軟件制作柱狀圖進一步說明結(jié)果數(shù)據(jù)。

1.7 免疫組化檢測

Morris水迷宮實驗結(jié)束，對小鼠(6只/組)進行灌注固定，斷頸處死，迅速腦組織用多聚甲醛固定液進行固定，石蠟包埋后從冠狀面切成4m薄片，接著進行烤片、脫蠟、消除內(nèi)源性過氧化物酶、抗原修復(fù)、抗體孵育、顯色、脫水、封片，最后每組選6張切片在×20倍顯微鏡視野下觀察海馬CA1區(qū)α7-nAChRs和mGluR5陽性細胞，并利用Image-pro Plus軟件進行分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方金思維對小鼠定位航行潛伏期的影響

實驗結(jié)果顯示，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加每組小鼠定向航行潛伏期均縮短，具體表現(xiàn)如下：實驗期間，與對照組比較，模型組潛伏期明顯增加(P<0.01)；與模型組相比較，第四天，多奈哌齊組和復(fù)方金思維小劑量組潛伏期均縮短(P<0.01或P<0.05)；第五天，與模型組相比，多奈哌齊組和金思維各劑量組潛伏期均減短(P<0.01或P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方金思維對各組小鼠定位航行潛伏期的影響

2.2 復(fù)方金思維對小鼠突觸結(jié)構(gòu)的影響

電鏡×7000倍視野下觀察小鼠突觸超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：對照組突觸結(jié)構(gòu)正常且清晰，突觸前膜有大量球形突觸小泡，可見清晰的線粒體，突觸間隙寬度及形態(tài)正常，突觸后膜厚度正常且均勻(圖1A)；模型組突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整，突觸內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)不清晰，突觸小泡分布零散且形態(tài)模糊(圖1B)；多奈哌齊組突觸結(jié)構(gòu)清晰，前膜和后膜形態(tài)正常，可見較為清晰的線粒體結(jié)構(gòu)，突觸間隙寬度正常(圖1C)；復(fù)方金思維各藥物組突觸形態(tài)及結(jié)構(gòu)均基本正常，其中中劑量組可見結(jié)構(gòu)完整且清晰的線粒體，小劑量組突觸前膜可見大量清晰的突觸小泡聚集，各組突觸間隙均寬度及形態(tài)正常(圖1D-F)。結(jié)果見圖1。

2.3 小鼠海馬CA1區(qū)α7-nAChRs和mGluR5陽性細胞數(shù)的變化

在×20倍顯微鏡視野下觀察海馬CA1區(qū)α7-nAChRs和mGluR5陽性細胞，實驗結(jié)果顯示：α7-nAChRs陽性細胞變化為：與對照組相比，模型組海馬CA1區(qū)陽性細胞數(shù)表達顯著減少(P<0.01)(圖2A、2B)；與模型組相比較，其他各藥物組海馬陽性細胞分布均較多(圖2C-F)，多奈哌齊組和復(fù)方金思維大劑量組表達均有所增加(P<0.05)。mGluR5陽性細胞變化為：與對照組相比，模型組陽性細胞數(shù)表達顯著增加(P<0.01)(圖3A、3B)；與模型組相比較，其他各藥物組海馬陽性細胞分布較少(圖3C-F)，多奈哌齊組，復(fù)方金思維大、中劑量組表達均有所減少(P<0.01或P<0.05)。綜合上述結(jié)果，多奈哌齊組和復(fù)方金思維大劑量組與模型組比較，海馬CA1區(qū)α7-nAChRs和mGluR5的陽性細胞數(shù)表達均有一定程度改善(P<0.05)。結(jié)果見圖2，圖3，表2。

注：A.對照組;B.模型組;C.多奈哌齊組;D.復(fù)方金思維大劑量組;E.復(fù)方金思維中劑量組;F.復(fù)方金思維小劑量組

注：A.對照組;B.模型組;C.多奈哌齊組;D.復(fù)方金思維大劑量組;E.復(fù)方金思維中劑量組;F.復(fù)方金思維小劑量組

注：A.對照組;B.模型組;C.多奈哌齊組;D.復(fù)方金思維大劑量組;E.復(fù)方金思維中劑量組;F.復(fù)方金思維小劑量組

表2 復(fù)方金思維對各組小鼠海馬CA1區(qū)α7-nAChRs和mGluR5陽性細胞數(shù)表達的影響

2.4 通過Western-blot實驗觀察小鼠海馬CA1區(qū)mGluR5的變化

實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組海馬CA1區(qū)該蛋白的表達有所增加(P<0.05)；與模型組比較，多奈哌齊組及復(fù)方金思維大、中劑量組小鼠海馬CA1區(qū)該蛋白的表達均有一定程度減少(P<0.01或P<0.05)。結(jié)果見表3，圖4。

表3 復(fù)方金思維對各組小鼠海馬CA1區(qū)mGluR5蛋白表達的影響

注：A.對照組；B.模型組；C.多奈哌齊組；D.復(fù)方金思維大劑量組；E.復(fù)方金思維中劑量組；F.復(fù)方金思維小劑量組

3 討論

突觸是神經(jīng)元的特殊結(jié)構(gòu)，神經(jīng)遞質(zhì)從突觸前軸突釋放到突觸間隙中，并激活突觸后樹突上的受體以傳遞信號[13]。隨著AD病情的發(fā)展，認(rèn)知功能逐步惡化，突觸丟失尤為突出，特別是在海馬和皮層中。研究證明淀粉樣蛋白如Aβ和tau蛋白的沉積可能是導(dǎo)致AD早期發(fā)病階段出現(xiàn)突觸衰竭的發(fā)病機制[14]。除此之外，AD中突觸丟失的機制還可能涉及軸突運輸缺陷，氧化應(yīng)激，線粒體損傷和神經(jīng)炎癥等[15]。在神經(jīng)傳遞過程中，信號分子如谷氨酸、乙酰膽堿、多巴胺等從突觸前神經(jīng)元的活動區(qū)域釋放出來，與突觸后神經(jīng)元的受體結(jié)合并激活受體。本實驗重點討論的突觸蛋白α7-nAChRs和mGluR5分別在神經(jīng)信號傳遞中起重要作用[16]。尼古丁乙酰膽堿受體是調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶功能的膽堿能信號重要介質(zhì)[17]，尼古丁乙酰膽堿受體的激活會增加小膠質(zhì)細胞對Aβ的吞噬作用，其亞型α7-nAChRs是調(diào)節(jié)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的重要蛋白，能夠提高學(xué)習(xí)記憶能力[18]。α7-nAChRs是一種配體門控離子通道受體，在細胞Ca2+信號傳導(dǎo)中起重要作用，通過G蛋白支架分子選擇性地作用于神經(jīng)元。除此之外，Aβ能夠與α7-nAChRs高度結(jié)合并阻礙正常的α7-nAChRs通道進而影響其正常功能。研究表明α7-nAChRs受體激動劑激活可以觸發(fā)Ca2+通道信號[19]，促進突觸發(fā)育和可塑性，因此α7-nAChRs是治療AD等神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵藥物靶點。在AD病理變化中另一重要變化是Aβ對谷氨酸系統(tǒng)的影響[20]，谷氨酸作為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，是影響突觸進行神經(jīng)信號傳遞的重要物質(zhì)，谷氨酸受體存在于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中，不同于離子型谷氨酸受體，與膜內(nèi)G蛋白偶聯(lián)的代謝性谷氨酸受體通過間接代謝過程激活進行興奮性傳遞，mGluR5受體主要在突觸后表達，激活該受體能夠促進Gαq/11蛋白活化，進而激活磷脂酶Cβ1，導(dǎo)致甘油二酯和三磷酸肌醇形成，促進Ca2+從細胞內(nèi)釋放， Aβo 的慢性堆積可能會降低mGluR5對Ca2+的敏感性。在突觸后密集區(qū)(postsynaptic density, PSD)，細胞外Aβo與脂錨定蛋白細胞朊蛋白(cellular prion protein , PrPc)共同激活酪氨酸蛋白激酶Fyn從而干擾突觸信號傳遞，在所有的跨膜PSD蛋白中，只有mGluR5支持Aβo-PrPc與Fyn激活的偶聯(lián)。細胞內(nèi)Ca2+和蛋白質(zhì)的翻譯也通過mGluR5的介導(dǎo)與Aβo-PrPc過程產(chǎn)生關(guān)聯(lián)[21]。樹突棘喪失和轉(zhuǎn)基因記憶障礙需要mGluR5發(fā)揮輔助受體作用?？傊琺GluR5激活是Aβo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵步驟，具有AD治療干預(yù)的潛力。

作為21世紀(jì)最嚴(yán)重的全球健康和社會危機之一的疾病，AD目前還沒有治療及治愈的方法，尋求有效治療方法和藥物，迫在眉睫。中醫(yī)藥治療AD獨具優(yōu)勢。AD基本中醫(yī)病機為髓海虧虛，痰瘀阻滯，情志所傷以及瘀阻腦絡(luò)所致腦失所養(yǎng)，神明失用。髓?？仗摵吞叼鲎杞j(luò)是AD最典型的基本病機，在此基礎(chǔ)之上，中藥復(fù)方金思維針對腎虛和痰濁的病機，根據(jù)補腎助陽，化痰祛濁的治療原則組方用藥[22]，方中人參大補元氣，安神益智，肉蓯蓉補腎陽，益精血，地黃填精益髓，補腎滋陰，茯苓補腎益精，石菖蒲和遠志豁痰開竅，醒神益智，郁金和丹參活血化瘀，養(yǎng)血安神，諸藥共奏補腎助陽，化痰祛濁之效，針對其腎虛之本和痰濁之標(biāo)進行治療。

本實驗通過Morris水迷宮測試小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加每組小鼠定向航行潛伏期均縮短；超微電鏡觀察結(jié)果顯示與模型組相比，復(fù)方金思維藥物組小鼠海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)有不同程度改善；通過免疫組化、Western-blot實驗觀察擬散發(fā)性AD小鼠海馬CA1區(qū)α7-nAChRs和mGluR5的表達和分布，免疫組化實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組海馬CA1區(qū)α7-nAChRs的陽性細胞數(shù)表達顯著減少，mGluR5的陽性細胞數(shù)表達顯著增加；與模型組相比較，多奈哌齊組和復(fù)方金思維大劑量組α7-nAChRs的陽性細胞數(shù)均有所增加，mGluR5有所減少，復(fù)方金思維中劑量組mGluR5的陽性細胞數(shù)也減少；Western-blot mGluR5實驗結(jié)果與免疫組化結(jié)果方向一致。這些結(jié)果說明中藥復(fù)方金思維能夠從一定程度上改善AD小鼠海馬區(qū)CA1區(qū)α7-nAChRs和mGluR5的分布和表達，推測可能是通過影響突觸結(jié)構(gòu)和突觸傳遞信號中相關(guān)蛋白進一步影響突觸傳遞及功能，改變AD病理表現(xiàn)，改善AD認(rèn)知能力。