蘭 娜，胡國花

（西電集團醫(yī)院麻醉科，西安 710077）

0 引言

隨著生活水平的不斷提高，糖尿病已經(jīng)成為繼心腦血管病、腫瘤后影響人類健康的第三大因素。在所有糖尿病類型中，以2 型糖尿病最為常見，多發(fā)生于40 歲以上的中老年人[1-2]。2 型糖尿病患者人數(shù)占糖尿病患者的90%以上，也是最常見的嚴(yán)重危害中老年人健康的慢性疾病[3-4]。神經(jīng)病理性疼痛是2 型糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，40%～50%的糖尿病患者存在神經(jīng)病理性疼痛[5]。其臨床表現(xiàn)為持續(xù)灼痛、間斷刺痛、撕裂痛、電擊痛等自發(fā)性疼痛以及痛覺過敏和痛覺超敏等刺激誘發(fā)性疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，疼痛長時間得不到解決則會出現(xiàn)抑郁甚至死亡。目前，臨床應(yīng)對2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的常用藥物包括鎮(zhèn)痛劑、抗抑郁藥、抗癲癇藥、血管擴張劑、神經(jīng)營養(yǎng)劑等，但是對于疼痛的治療、改善效果十分有限，且會產(chǎn)生耐藥性[6-7]。交變電磁輻照作為一種臨床常見的物理治療方法，已經(jīng)在神經(jīng)損傷、骨骼肌創(chuàng)傷、心血管疾病康復(fù)中發(fā)揮積極作用[8-9]。研究也發(fā)現(xiàn)交變電磁輻照具有積極的抗炎和鎮(zhèn)痛療效[10-11]。但是目前國內(nèi)外尚未見交變電磁輻照對于糖尿病，尤其是發(fā)生率更高、危害更為廣泛的2 型糖尿病所誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛的治療效果的相關(guān)研究報道。本文以2 型糖尿病（db/db）小鼠為實驗對象，對其進行行為學(xué)、神經(jīng)電生理、分子生物學(xué)檢測，旨在闡明交變電磁輻照對2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的作用效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

血糖分析儀，購于美國Lifescan 公司；Von Frey纖維絲，購于美國Stoelting 公司；熱痛敏檢測系統(tǒng)，購于意大利Commat 公司；麻醉劑戊巴比妥鈉，購于美國Sigma 公司；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購于北京天根生物技術(shù)公司；Maxima SYBR Green qPCR 試劑盒，購于美國Thermo 公司；Trizol（用于RNA 提取），購于美國Invitrogen 公司。

1.2 實驗動物及分組

2 型糖尿?。╠b/db）小鼠（C57BKS 背景，BKS.Cg-m+/+Leprdb/J），3 月齡，雄性，SPF 級，購于美國Jackson 實驗室；與db/db 小鼠同背景的野生型小鼠，3 月齡，雄性，SPF 級，購于美國 Jackson 實驗室。全部動物實驗方案遵從美國國立衛(wèi)生研究院的實驗動物使用指南。實驗動物飼養(yǎng)于恒溫22～24 ℃、恒濕50%～60%及恒定光照（12 h 光照、12 h 黑暗）的實驗條件。全部動物適應(yīng)本實驗室環(huán)境1 周，隨后通過尾靜脈提取靜脈血（晨血），測定隨機血糖值，血糖值＞16.7 mmol/L 且具有明顯多飲、多食、多尿特征的小鼠被納入本研究。30 只小鼠（20 只 db/db 小鼠及 10 只野生型小鼠）被分成3 組，每組10 只，分別為：野生型小鼠組（wild-type 組）、db/db 小鼠組（db/db 組）、db/db 小鼠接受交變電磁輻照（alternating electromagnetic fields，EMF）治療組（db/db+EMF 組）。其中，db/db+EMF 組小鼠給予全身交變電磁輻照刺激，每天1 h。wild-type 組和db/db 組的小鼠予以假交變電磁輻照暴露干預(yù)。

1.3 電磁照射裝置

電磁照射裝置由電磁發(fā)生器和Helmholtz 線圈組成。電磁發(fā)生器由MSP430 單片機控制產(chǎn)生頻率、強度線性可調(diào)的正弦交變電磁信號，該信號經(jīng)過后續(xù)的信號調(diào)制、整合、濾波、放大處理后，將電流輸出至Helmholtz 線圈。Helmholtz 線圈包含2 個相同直徑（40 cm）且等軸放置的線圈組，線圈匝數(shù)為100，線圈間距為20 cm。實驗所產(chǎn)生的交變電磁場峰值強度為5 mT，頻率為50 Hz。

1.4 行為學(xué)檢測

交變電磁輻照干預(yù)的第 0、1、2、3、4 周對 3 組小鼠分別進行足底機械痛閾值和熱痛閾值的測定分析。機械痛閾值檢測步驟：將小鼠置于單獨的鐵絲籠內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境30 min 后，使用Von Frey 纖維絲對小鼠后足的足底給予刺激，在刺激過程中或移開纖維絲時，小鼠出現(xiàn)明顯的抬足反射則記錄為陽性，未出現(xiàn)抬足反射則記錄為陰性。每一標(biāo)號的纖維絲對每側(cè)足刺激5 次（雙側(cè)10 次），如出現(xiàn)5 次以上陽性反應(yīng)，則記錄該纖維絲力度為被采集指標(biāo)。如果發(fā)現(xiàn)實驗動物出現(xiàn)5 次不抬腿的情況，則換用更高刻度的纖維絲。熱痛閾值檢測步驟：將小鼠置于單獨的塑料籠內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境30 min。應(yīng)用熱輻射測痛儀發(fā)射光束照射小鼠足底中部，小鼠無法耐受熱痛出現(xiàn)抬足反射，此時光束自動切斷，記錄反應(yīng)時間。每只小鼠單側(cè)足底刺激5 次（雙側(cè)共10 次），每次間隔10 min，記錄10 次的測量值并取平均值。

1.5 神經(jīng)電生理檢測

交變電磁輻照干預(yù)的第 0、1、2、3、4 周對 3 組小鼠感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速率（sensory nerve conduction velocity，SNCV）進行測試。對各組小鼠行腹腔注射戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg）進行麻醉，充分麻醉后將小鼠置于設(shè)有輔熱裝置的實驗臺。將2 個刺激電極分別插入小鼠的膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)中，待電極植入穩(wěn)定后通入電流，采用生物信號采集系統(tǒng)記錄復(fù)合動作電位的潛伏期（即神經(jīng)傳導(dǎo)時間），同時測定、記錄電極和刺激電極之間的沿著神經(jīng)走向的間隔距離，計算獲得神經(jīng)傳導(dǎo)速率。

1.6 分子生物學(xué)檢測

交變電磁輻照干預(yù)4 周后，對各組全部小鼠使用過量戊巴比妥鈉溶液處死。隨后通過RNA 提取試劑盒提取腰段脊髓L5 背角位置的總RNA，以2 μg RNA 為上樣量，在20 μL 反應(yīng)體系中對提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR 儀對所選取目標(biāo)基因行PCR 擴增，引物序列如下：白細胞介素-1β（IL-1β）上游引物 5′-GTGGCTGTGGAGAAGCTGTGGC-3′，IL-1β 下游引物 5′-TGGG-TCCGACAGCACGAGGC-3′；p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）上游引物5′-TGAACTTCGCAAATGTATTTATTGGT-3′，p38 MAPK 下游引物 5′-ATCTGAGTCCAAAACGAGCATCT-3′；GAPDH（內(nèi)參基因）上游引物5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，GAPDH 下游引物 5′-TGTAGACCATGTAGTTGA GGTCA-3′。qPCR 的反應(yīng)體系為：cDNA 模板 1.6 μL，上、下引物（濃度為 10 μmol/L）各 0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，最后使用去離子水將反應(yīng)體系補充至20 μL。具體反應(yīng)條件為：95 ℃變性預(yù)處理 3 min，隨后 95 ℃變性 30 s、60 ℃退火 30 s，循環(huán) 40 次。每種基因設(shè)置 4 個復(fù)孔，使用 2-ΔΔCT法對p38 MAPK 和IL-1β 的相對表達量進行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 交變電磁輻照對db/db 小鼠體質(zhì)量和血糖的影響

各組小鼠的體質(zhì)量比較如圖1（a）所示，可以看出，db/db 組小鼠的體質(zhì)量在4 周的實驗期內(nèi)均顯著高于 wild-type 組小鼠（P＜0.05），同樣 db/db+EMF 組小鼠體質(zhì)量在各時間點也顯著高于wild-type 組小鼠（P＜0.05），但是 db/db 組與 db/db+EMF 組小鼠的體質(zhì)量在各時間點無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。各組小鼠的血糖值比較如圖1（b）所示，可以看出，db/db 組和db/db+EMF 組小鼠的血糖值在各時間點顯著高于wild-type 組小鼠（P＜0.05），但 db/db 組與 db/db+EMF組之間的血糖值無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 交變電磁輻照對db/db 小鼠足底機械痛閾值和熱痛閾值的影響

圖1 交變電磁輻照對db/db 小鼠體質(zhì)量和血糖的影響

如圖 2（a）所示，與 wild-type 組相比，db/db 組小鼠的足底機械痛閾值在實驗的第 0、1、2、3、4 周均顯著性降低（P＜0.05），db/db+EMF 組小鼠足底機械痛閾值在第0 周與db/db 組無明顯差異，但是在第1、2、3、4 周均顯著高于 db/db 組小鼠（P＜0.05），并且db/db+EMF 組小鼠足底機械痛閾值在第 2、3、4 周與wild-type 組小鼠無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。如圖 2（b）所示，db/db 組小鼠足底熱痛閾值在實驗的第0、1、2、3、4 周均顯著低于 wild-type 組小鼠（P＜0.05），db/db+EMF 組小鼠足底熱痛閾值在實驗的第 1、2、3、4周均顯著高于 db/db 組小鼠（P＜0.05），同時 db/db+EMF 組小鼠足底熱痛閾值在第3、4 周與wild-type組小鼠無明顯差異（P＞0.05）。

2.3 交變電磁輻照對db/db 小鼠SNCV 的影響

各組小鼠在實驗各時間點SNCV 的比較如圖3所示。db/db 組小鼠的 SNCV 在實驗的第 0、1、2、3、4周均顯著低于 wild-type 組小鼠（P＜0.05）。db/db+EMF組小鼠的 SNCV 在第 0 周與 db/db 組無差異（P＞0.05），但在第 1、2、3、4 周均顯著高于 db/db 組小鼠（P＜0.05）。同時，db/db+EMF 組小鼠的 SNCV 在第 1、2、3、4 周均顯著低于 wild-type 組小鼠（P＜0.05）。

2.4 交變電磁輻照對db/db 小鼠脊髓IL-1β和p38 MAPK 表達的影響

圖2 交變電磁輻照對db/db 小鼠足底機械痛閾值和熱痛閾值的影響

圖3 交變電磁輻照對db/db 小鼠SNCV 的影響

如圖 4 所示，db/db 組小鼠的脊髓 IL-1β 和 p38 MAPK 的基因表達水平均顯著高于wild-type 對照組小鼠（P＜0.05），db/db+EMF 組小鼠的脊髓 IL-1β 和p38 MAPK 的mRNA 表達含量顯著低于db/db 組小鼠（P＜0.05），而 db/db+EMF 組小鼠與 wild-type 組小鼠的脊髓IL-1β 和p38 MAPK 的基因表達水平未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

3 討論

圖4 交變電磁輻照對db/db 小鼠脊髓IL-1β 和p38 MAPK 基因表達的影響

電磁輻照是臨床理療科重要的治療手段，已被證實能夠在加速骨折愈合、軟組織損傷修復(fù)、局部微循環(huán)改善、神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙改善等方面發(fā)揮積極作用[12]。電磁輻照的治療波形多種多樣，包括穩(wěn)恒波式、脈沖波式、三角波式、正弦波式等，其中正弦交變電磁輻照憑借其更易獲取的優(yōu)勢（可直接從市電進行轉(zhuǎn)換獲得）在臨床諸多疾病的治療中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，正弦交變電磁輻照具有消炎、鎮(zhèn)痛的功效[10-11]。但是，正弦電磁輻照是否能夠改善糖尿病尤其是2 型糖尿病的神經(jīng)病理性疼痛癥狀，目前仍是未知。本研究中，使用瘦素受體基因（db）純合突變的db/db 小鼠作為研究對象模擬臨床2 型糖尿病。該小鼠具有肥胖、高血糖、多尿、高尿糖等與人類2 型糖尿病諸多相似的體征，也是迄今研究2 型糖尿病及其并發(fā)癥最為經(jīng)典的動物模型[13-14]。

為了檢測2 型糖尿病（db/db）小鼠機體對于外界刺激的承受能力，本研究分別進行了足底機械痛閾值和熱痛閾值的檢測，發(fā)現(xiàn)db/db 小鼠的足底機械痛閾值和熱痛閾值均顯著低于wild-type 組小鼠，提示該小鼠疼痛耐受能力顯著降低，這與臨床2 型糖尿病患者神經(jīng)病理性疼痛體征一致[15]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，全身交變電磁輻照1 周開始對db/db 小鼠的疼痛耐受能力產(chǎn)生顯著的改善效應(yīng)，并且隨著治療進程的推進，改善效應(yīng)越為明顯，在治療的第3 周基本可接近wild-type 組小鼠水平。本研究中對行為學(xué)的研究結(jié)果提示，全身交變電磁輻照對2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的癥狀改善具有顯著效果。

SNCV 是用于評定周圍神經(jīng)傳導(dǎo)功能的一項神經(jīng)電生理診斷技術(shù)，同時也是評價軸索損害的重要指標(biāo)[16]。學(xué)者們前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛患者的SNCV 顯著降低，且SNCV 的改變對于糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的敏感度高于運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度（motor nerve conduction velocity，MNCV）的改變[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病（db/db）小鼠在實驗各時間點的SNCV 均顯著低于wild-type 組，提示db/db 小鼠具有明顯的神經(jīng)傳遞障礙的特性。而使用交變電磁輻照后，db/db 小鼠SNCV 的降低得到了顯著改善，且這一效果在交變電磁輻照的早期表現(xiàn)得十分明顯，而上述變化趨勢也與足底機械痛閾值和熱痛閾值的變化趨勢類似。本研究結(jié)果也提示SNCV是反映交變電磁輻照改善2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的一項重要指標(biāo)。

2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展與持續(xù)性的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，而IL-1β 是這其中最重要的促炎性細胞介質(zhì)，也被認(rèn)為是2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的重要標(biāo)志性細胞因子[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，db/db 小鼠脊髓中IL-1β 的基因表達含量顯著高于wild-type 組小鼠，這與前人的研究結(jié)果一致[20]，進一步證實了2 型糖尿病會誘導(dǎo)機體處于高炎性反應(yīng)狀態(tài)。本研究結(jié)果表明，4 周的全身交變電磁輻照能夠顯著降低db/db 小鼠脊髓中IL-1β 的表達，降低至接近wild-type 組的水平（與wild-type 組無統(tǒng)計學(xué)差異），提示交變電磁輻照對2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)的炎性反應(yīng)具有顯著的抑制效應(yīng)。

2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛會伴隨有諸多分子信號通路的激活，而近年來學(xué)者們的研究發(fā)現(xiàn)與糖尿病神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)的多條信號通路會匯集于p38 MAPK 分子[21-22]。p38 MAPK 在激活神經(jīng)膠質(zhì)細胞、痛覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及神經(jīng)元可塑性變化中發(fā)揮重要作用，而對于p38 MAPK 高選擇性靶向藥物也是有前景的糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的潛在治療方式[23]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，db/db 小鼠脊髓中p38 MAPK 的基因表達顯著高于wild-type 組小鼠，進一步證實了p38 MAPK 參與2 型糖尿病db/db 小鼠的神經(jīng)病理性疼痛進程。而全身交變電磁輻照能夠顯著抑制脊髓p38 MAPK 的表達，提示交變電磁輻照對抗2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的潛在機制與其抑制p38 MAPK的表達有關(guān)。

本研究探究了4 周的全身交變電磁輻照對2 型糖尿病db/db 小鼠神經(jīng)病理性疼痛的治療效果，明確了該方法能夠有效抑制2 型糖尿病db/db 小鼠的神經(jīng)病理性疼痛癥狀，并初步探索了該作用的潛在機制，有望為臨床對抗2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛提供新的治療策略。本研究的不足之處在于只從基因水平對脊髓重要細胞因子表達進行了定量分析，而未從蛋白的水平對脊髓重要細胞因子表達進行定量。在后續(xù)研究中，將通過在體基因沉默技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因小鼠模型進一步闡明電磁輻照對2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛治療的潛在機制。