朱慶元 李天晴

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650093）

相對(duì)于Bulk RNA-seq測(cè)量的是測(cè)序組織所有細(xì)胞同一基因混在一起平均化后的表達(dá)水平，scRNAseq技術(shù)以其高分辨率和測(cè)序深度對(duì)每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，對(duì)心臟研究領(lǐng)域產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，心臟迅速地完成了高度精細(xì)復(fù)雜的心臟發(fā)生過(guò)程［1-2］，在妊娠大約21 d就開(kāi)始跳動(dòng)，是第1個(gè)發(fā)揮生理功能的實(shí)質(zhì)臟器［3］。目前通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序，在小鼠模型上，已經(jīng)對(duì)心臟發(fā)生在時(shí)空層面已經(jīng)有了更好的理解［4］，同時(shí)人鼠心臟發(fā)育具有巨大物種差異，對(duì)人類胎心的單細(xì)胞測(cè)序也在心臟發(fā)育的時(shí)間層面上以及細(xì)胞類型之間發(fā)現(xiàn)了人鼠特異基因的表達(dá)［5］，這些對(duì)體外心肌分化研究也有非常重要的意義［6］。本文概述了scRNA-seq技術(shù)在心臟發(fā)育、疾病以及醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用及作出相應(yīng)展望。

1 scRNA-seq測(cè)序技術(shù)的進(jìn)展

2009年，Tang等［7］首次報(bào)道了3'偏倚的全長(zhǎng)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法。2011年，Islam等［8］建立了STRT-seq（Single-cell tagged reverse transcription sequencing），能夠在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中給每個(gè)細(xì)胞加上條形碼，從而能夠同時(shí)對(duì)更多量的各種混合細(xì)胞樣本 測(cè) 序。2012年，Smart-seq（Switching mechanism at 5'end of the RNA transcript）出現(xiàn)，不僅能夠檢測(cè)mRNA的全長(zhǎng)，而且有更高的轉(zhuǎn)錄本序列覆蓋度［9］。同 年，Hashimshony等［10］開(kāi) 發(fā) 出CEL-seq（Cell expression by linear amplification and sequencing），進(jìn)行雙端深度測(cè)序能夠準(zhǔn)確檢測(cè)兩條鏈的序列，并且給每個(gè)細(xì)胞加上條形碼，實(shí)現(xiàn)了混樣單細(xì)胞的多重分析和研究。2013年，Picelli等［11］開(kāi)發(fā)出 Smartseq2技術(shù)，相比Smart-seq技術(shù)，產(chǎn)物無(wú)需純化，產(chǎn)量提升。

同年，第一臺(tái)商業(yè)化單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組制備系統(tǒng)Fluidigm C1面世，能夠自動(dòng)捕獲單個(gè)細(xì)胞并完成Smart-seq操作。2014年，Jaitin等［12］建立了MARSseq（Massively parallel single cell RNA-seq）技術(shù)，可分析上千個(gè)單細(xì)胞在體轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。2015年，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)中引入微流控技術(shù)，利用微流體裝置將帶有條形碼的微珠和細(xì)胞一起包裹進(jìn)油滴，隨后條形碼連接到反轉(zhuǎn)錄后的cDNA上進(jìn)行標(biāo)記。其中Marc領(lǐng)導(dǎo)開(kāi)發(fā)的inDrop只有約15萬(wàn)個(gè)條形碼，處理的細(xì)胞數(shù)少，但捕獲效率高，適用于細(xì)胞數(shù)量少珍貴的樣本［13］。而Steven等開(kāi)發(fā)的Drop-seq有1600萬(wàn)個(gè)條形碼，可以處理大量細(xì)胞［14］。2017年，商業(yè)化的10×Genomics技術(shù)出現(xiàn)，其在微流控技術(shù)基礎(chǔ)上引入16個(gè)堿基總計(jì)400萬(wàn)個(gè)細(xì)胞身份條形碼，進(jìn)一步降低了技術(shù)門檻，使得更多實(shí)驗(yàn)室可以進(jìn)行大規(guī)模單細(xì)胞測(cè)序的研究［15］。

在技術(shù)實(shí)現(xiàn)高通量后，針對(duì)scRNA-seq成本高昂的問(wèn)題，降低測(cè)序成本的相關(guān)技術(shù)得到發(fā)展。2017年，Gierahn等［16］開(kāi)發(fā)Seq-Well技術(shù)，利用每個(gè)納米孔中捕獲1個(gè)細(xì)胞和1個(gè)帶條形碼微珠，使每個(gè)細(xì)胞的成本低于1美元。隨后2018年，Han等［17］的Microwell-seq測(cè)序平臺(tái)利用瓊脂糖材料，使得單細(xì)胞建庫(kù)測(cè)序的成本進(jìn)一步降低。同年，使用SPLit-seq技術(shù)可以無(wú)需對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分離，而是形成單獨(dú)的RNA“隔離室”，為每個(gè)細(xì)胞的RNA引入一個(gè)獨(dú)特的組合條碼，可以特異性地標(biāo)記百萬(wàn)數(shù)量級(jí)的細(xì)胞［18］。

此外，空間轉(zhuǎn)錄組迅速發(fā)展，目前Slide-Seq技術(shù)可以將RNA從組織樣本轉(zhuǎn)移到覆蓋有已知位置的DNA條形碼珠子的表面，從而允許通過(guò)測(cè)序確定RNA的空間位置［19］。這種方法將轉(zhuǎn)錄組映射的空間分辨率提高到10 μm，以接近單細(xì)胞的分辨率為scRNA-seq技術(shù)提供了空間維度。隨著scRNAseq技術(shù)門檻及測(cè)序成本降低（表1），小鼠和人的心臟單細(xì)胞測(cè)序陸續(xù)地發(fā)表出來(lái)，讓更多實(shí)驗(yàn)室可從心臟單細(xì)胞水平研究心臟發(fā)育、疾病以及醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

2 scRNA-seq測(cè)序技術(shù)探究胚胎心臟發(fā)育

表1 主要scRNA-seq測(cè)序技術(shù)

目前運(yùn)用到心臟研究中的主流的scRNA- seq技術(shù) 有Smart-seq2、10×Genomics和Smart-seq/C1等（圖1）。2016年，Li和DeLaughter等分別獨(dú)立采用Smart-seq/C1技術(shù)發(fā)表了世界上前兩篇小鼠心臟單細(xì)胞測(cè)序文章，通過(guò)對(duì)不同發(fā)育階段的胚胎心臟的特定幾個(gè)解剖區(qū)域進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，第一次得到了主要心臟細(xì)胞類型的單細(xì)胞圖譜［23-24］。Li等［23］使用隨機(jī)森林算法分析了胚胎第8.5-10.5天的小鼠心臟的轉(zhuǎn)錄圖譜，并以超過(guò)91%的準(zhǔn)確率成功預(yù)測(cè)心肌單細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中的解剖位置，并以譜系示蹤技術(shù)證實(shí)了Isl1標(biāo)記的細(xì)胞主要分布在流出道和右心室處。DeLaughter等［24］則進(jìn)行了胚胎第9.5天到出生后第21天的心臟細(xì)胞的測(cè)序，闡釋了胎心成熟過(guò)程中心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜的變化。此外這兩項(xiàng)研究都闡釋了胚胎發(fā)育過(guò)程中心肌細(xì)胞類型的異質(zhì)性并發(fā)現(xiàn)Nkx2.5的缺陷會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞成熟障礙。

圖1 胚胎心臟研究中用到的scRNA-seq技術(shù)的開(kāi)發(fā)和運(yùn)用時(shí)間表

2018年，Lescroart 等［25］利用Smart-seq2技術(shù)對(duì)96個(gè)細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)了Mesp1在心血管細(xì)胞譜系分離的最早階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過(guò)對(duì)比小鼠野生型的和Mesp1陰性的心血管祖細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)Mesp1是祖細(xì)胞退出多能性和在早期原腸形成過(guò)程中誘導(dǎo)心臟基因表達(dá)所必需的，并且不同的Mesp1前體細(xì)胞群對(duì)應(yīng)于不同的細(xì)胞譜系和不同解剖區(qū)域的心臟祖細(xì)胞。

2019年，Cui等［5］利用改良的STRT-seq進(jìn)行了首個(gè)人類心臟高精度發(fā)育細(xì)胞圖譜的繪制。該研究通過(guò)對(duì)來(lái)自18個(gè)人類胚胎（孕期從5周到25周）的大約4000個(gè)解剖學(xué)定義的心臟細(xì)胞單細(xì)胞測(cè)序，鑒定出心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和瓣膜間質(zhì)細(xì)胞4種主要的心臟細(xì)胞類型，并且發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中經(jīng)歷了基因表達(dá)的逐步變化。通過(guò)人和小鼠心臟單細(xì)胞數(shù)據(jù)的比較分析，發(fā)現(xiàn)了人類心臟發(fā)育的幾個(gè)獨(dú)特特征，這些差異在整體組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中不明顯，但在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平上十分明顯。4種細(xì)胞類型中，人和小鼠的心肌細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組上最相似。而在發(fā)育階段上，小鼠胚胎10.5 d的心肌和第7周的人的心肌發(fā)育最好的同步，而小鼠胚胎10.5 d的心臟內(nèi)皮和人第6周的心臟內(nèi)皮發(fā)育最同步，小鼠胚胎9.5 d的成纖維細(xì)胞和人第5周的最同步，表明小鼠和人在發(fā)育過(guò)程中心臟細(xì)胞類型的分化和成熟具有各自的同步時(shí)間線。此外，RNASE1在人內(nèi)皮細(xì)胞中特異表達(dá)，THY1在人成纖維細(xì)胞中特異表達(dá)，CFB和ITLN1在人心外膜細(xì)胞中特異表達(dá)，并且人的心肌更多地表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)基因COL1A1、COL6A3、DCN和LUM，而這些基因很少或不在在小鼠對(duì)應(yīng)細(xì)胞類型上表達(dá)，相比之下，Icam2在小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中特異表達(dá)，Rnf213在小鼠心外膜細(xì)胞中特異表達(dá)。這些突顯了心臟不同細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組在物種間的相似性和差異性，便于研究者在了解人鼠不同細(xì)胞類型基因表達(dá)差異的基礎(chǔ)上，選擇細(xì)胞類型相近的，可以直接用小鼠研究，相差較遠(yuǎn)的要注意小鼠模型得出結(jié)論的可靠性。另外在發(fā)育階段上，要根據(jù)研究重點(diǎn)選擇人鼠細(xì)胞類型發(fā)育階段匹配的時(shí)期研究。

2019年12 月Asp等［26］運(yùn) 用10×Genomics技術(shù)結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，首次將心臟單細(xì)胞分群信息與空間信息相結(jié)合繪制了懷孕前3個(gè)月發(fā)育中的人類心臟發(fā)育的單細(xì)胞水平三維時(shí)空?qǐng)D譜。10×Genomics技術(shù)測(cè)得的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組對(duì)應(yīng)空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，對(duì)整個(gè)心肌切片測(cè)序，恢復(fù)了單細(xì)胞測(cè)序完全丟失的空間信息，高精度和高準(zhǔn)確度繪制了心臟細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜總體相似屬于同一細(xì)胞類型但空間分布不同的圖譜，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)嵴細(xì)胞和施旺前體細(xì)胞都定位在縱隔間質(zhì)和流出道，并且施旺前體細(xì)胞還發(fā)現(xiàn)于房室外膜下間質(zhì)，神經(jīng)嵴細(xì)胞只在早期階段出現(xiàn)，施旺細(xì)胞在晚期出現(xiàn)，證實(shí)了神經(jīng)嵴細(xì)胞對(duì)流出道分隔成主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈是必須的。

3 scRNA-seq測(cè)序技術(shù)探究人心臟細(xì)胞的異質(zhì)性

由scRNA-seq產(chǎn)生的細(xì)胞圖譜表明，心臟及其周圍血管系統(tǒng)由多種細(xì)胞類型組成，包括心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、瓣膜間質(zhì)細(xì)胞和常駐免疫細(xì)胞，每種細(xì)胞類型都可以進(jìn)一步劃分為亞型（表2）。

心肌目前可以分為5種亞型，其中新發(fā)現(xiàn)了特異表達(dá)MYOZ2和FABP3的myoz2心肌［5，26］。心房肌 高 表 達(dá)NR2F1、FOS、HEY1、EGR2、CREB3L2和HAND2；而HAND1、HEY2、IRX3和NFIA則特異性表達(dá)在心室肌，此外跟心房肌相比，心室肌更高的表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)基因DCN和FBN2。從轉(zhuǎn)錄因子來(lái)看，轉(zhuǎn)錄因子IRX3和HAND1在左心室高表達(dá)對(duì)左心室發(fā)育至關(guān)重要，房性心律失常相關(guān)基因PITX2則在左心房高表達(dá)。此外心肌又可以分為致密化心肌和小梁肌，其中小梁肌表達(dá)NPPA和GJA5等標(biāo)志基因［23］。致密化心肌和小梁肌又都可以進(jìn)一步通過(guò)標(biāo)志基因區(qū)分是位于心房還是心室。致密化心室肌特異表達(dá)MYH7，S100A4和LBH，而致密化心房肌則特異表達(dá)MYH6，MYL7和ULK4；ITGA6和RELN特異富集在心房的小梁肌，CRABP2和SLIT2則特異富集在心室的小梁肌。通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序獲得各種心肌細(xì)胞亞型的標(biāo)記基因，在此基礎(chǔ)上對(duì)特定細(xì)胞亞型做進(jìn)一步研究。

內(nèi)皮細(xì)胞可以分為4種亞型，其中對(duì)于心內(nèi)膜細(xì)胞，Cui等［5］和Asp等［26］可能因?yàn)槿狈ο嚓P(guān)心臟方面的背景知識(shí)，把它當(dāng)成了毛細(xì)血管內(nèi)皮。心內(nèi)膜細(xì)胞是一種內(nèi)皮細(xì)胞，表達(dá)CDH5、PECAM1等內(nèi)皮標(biāo)記的同時(shí)，特異表達(dá)NPR3，可以作為心內(nèi)膜區(qū)別冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮等其他內(nèi)皮的特異標(biāo)記基因。瓣膜內(nèi)皮則更高的表達(dá)NTRK2和NFATC1。冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮特異表達(dá)FABP4和CD36，與血管發(fā)育和促進(jìn)心肌脂肪酸的使用相關(guān)，且它們對(duì)脂質(zhì)的作用與成體后發(fā)生冠狀動(dòng)脈粥樣硬化有很大關(guān)系。

單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組顯示［5，26］，胚胎第5周心外膜還未出現(xiàn)時(shí)，心外膜前體細(xì)胞既表達(dá)UPK3B、ALDH1A2、WT1和TBX18等心外膜標(biāo)記，但其基因表達(dá)模式又和心外膜不同，其增殖細(xì)胞率是非免疫細(xì)胞中最高的，特異表達(dá)NOTCH信號(hào)通路的兩個(gè)靶基因HEY1和HEY2，可能其命運(yùn)被NOTCH信號(hào)通路所控制。而心外膜細(xì)胞更加成熟，表達(dá)補(bǔ)體成分基因CFB、C3、C1R和C1S以及細(xì)胞外基質(zhì)基因ELN和DPT?？臻g轉(zhuǎn)錄組顯示，心外膜前體細(xì)胞表達(dá)TCF21主要位于房室心外膜下間質(zhì)。

結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組區(qū)分位置，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組提示亞型功能，心臟中分出5種成纖維細(xì)胞［26］。第1種成纖維樣細(xì)胞主要集中在流出道根部和瓣膜，第2種成纖維樣細(xì)胞主要在流出道和形態(tài)發(fā)生相關(guān)，第3種成纖維樣細(xì)胞和心外膜前體細(xì)胞一樣都定位在房室心外膜下間充質(zhì)，可能和冠脈形成有關(guān)。心外膜下第4種成纖維樣細(xì)胞和結(jié)締組織發(fā)育以及血管發(fā)生有關(guān)。第5種成纖維樣細(xì)胞定位更朝向流出道，與動(dòng)脈和主動(dòng)脈形態(tài)發(fā)生相關(guān)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

表2 心臟細(xì)胞主要類型及其基因表達(dá)特點(diǎn)和空間定位

4 scRNA-seq測(cè)序技術(shù)在心臟健康大動(dòng)脈和動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)脈方面的研究

將scRNA-seq與譜系示蹤轉(zhuǎn)基因小鼠相結(jié)合，揭示了冠狀動(dòng)脈是由發(fā)育過(guò)程中靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變的特定動(dòng)脈內(nèi)皮前體細(xì)胞群所分化而來(lái)［27］。這類單細(xì)胞群的轉(zhuǎn)錄譜由靜脈表型逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閯?dòng)脈表型，其中靜脈的特異性轉(zhuǎn)錄因子Couptf2為這種命運(yùn)轉(zhuǎn)換的核心轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)一步研究靜脈衍生動(dòng)脈的機(jī)制奠定了分子基礎(chǔ)。人的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組顯示人的冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮特異表達(dá)FABP4和CD36，與血管發(fā)育和促進(jìn)心肌脂肪酸的使用相關(guān)，且它們對(duì)脂質(zhì)的作用與成體后發(fā)生冠狀動(dòng)脈粥樣硬化有很大關(guān)系［26］，對(duì)冠狀動(dòng)脈這兩個(gè)特異基因的研究有可能找到預(yù)測(cè)發(fā)生冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)，以及研發(fā)藥物預(yù)防冠狀動(dòng)脈粥樣硬化及繼發(fā)的心肌梗塞。通過(guò)健康成年小鼠的主動(dòng)脈單細(xì)胞圖譜確定了主動(dòng)脈的所有細(xì)胞類型［28］，進(jìn)一步比較了8周和18個(gè)月小鼠的主動(dòng)脈，發(fā)現(xiàn)年輕和老年小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞種群在轉(zhuǎn)錄水平上存在顯著差異［29］。

scRNA-seq還被用來(lái)研究主要血管疾病的細(xì)胞狀態(tài)和命運(yùn)決定。動(dòng)脈粥樣硬化后由多種細(xì)胞類型組成，包括內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和免疫細(xì)胞，其中血管平滑肌細(xì)胞是具有高度可塑性的終末分化的細(xì)胞類型，單細(xì)胞分析的將其定義為一群特異的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，并進(jìn)一步鑒定出引導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的分化狀態(tài)的特定的組蛋白變體［30-31］。動(dòng)脈粥樣硬化的典型特征還包括大量的免疫細(xì)胞，但由于細(xì)胞標(biāo)記物的缺乏，巨噬細(xì)胞亞群的功能和表型都沒(méi)有很好的定義，為此，將健康和動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈中巨噬細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，鑒定出病變主動(dòng)脈中富集的髓系亞群［32］。這些亞群包括單核細(xì)胞、單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞和兩個(gè)巨噬細(xì)胞亞群。這些巨噬細(xì)胞群僅見(jiàn)于動(dòng)脈粥樣硬化后的主動(dòng)脈，Trem2和Il1β等炎癥分子高表達(dá)。類似地，將單細(xì)胞測(cè)序與質(zhì)譜分析相結(jié)合，在小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中鑒定出11種不同的白細(xì)胞類型，這些主動(dòng)脈白細(xì)胞的組成可以用來(lái)預(yù)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化患者的臨床事件，體現(xiàn)出單細(xì)胞測(cè)序臨床轉(zhuǎn)換潛力［33］。

5 scRNA-seq測(cè)序技術(shù)與多能干細(xì)胞分化心血管的研究

人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞模型已經(jīng)被證明在特定患者的疾病建模和再生治療中是有用的，但多能干細(xì)胞來(lái)源的心血管細(xì)胞還是存在成熟度不夠和異質(zhì)性較大的問(wèn)題。因此，許多研究已經(jīng)使用scRNA-seq來(lái)確定參與分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控的信號(hào)通路，識(shí)別由分化引起的所有細(xì)胞類型，并優(yōu)化和修改方案以產(chǎn)生成熟和均質(zhì)性較高的心臟血管細(xì)胞亞型。Friedman等［34］在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞干細(xì)胞分化心肌（Induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes，iPSC-CMs）分化的不同階段對(duì)超過(guò)40000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq測(cè)序，發(fā)現(xiàn)HOPX的調(diào)節(jié)失調(diào)導(dǎo)致了iPSC-CMs持續(xù)的未成熟狀態(tài)。在另一項(xiàng)單獨(dú)的研究中，取了iPSC-CMs分化過(guò)程中大約10000個(gè)細(xì)胞鑒定心臟轉(zhuǎn)錄因子發(fā)現(xiàn)表達(dá)NR2F2和TBX5的iPSC-CMs具有更不成熟和心房樣的特征，而HEY2、IRX4和MYL2富集表達(dá)在更成熟的心室肌。通過(guò)基因編輯NR2F2和HEY2，證實(shí)了這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子分別產(chǎn)生心房樣和心室樣iPSC-CMS的調(diào)控作用［35］?？傊?，這些研究結(jié)果突出了iPSC-CMS的異質(zhì)性，并揭示了控制細(xì)胞成熟和腔室特化的特定心臟轉(zhuǎn)錄因子。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化來(lái)源的內(nèi)皮細(xì) 胞（iPSC-derived endothelial cells，iPSC-ECs）與iPSC-CMS一樣受到細(xì)胞不成熟和異質(zhì)性的限制。在iPSC-ECs的分化過(guò)程中鑒定出4個(gè)主要的iPSC-ECs亞群，CLDN5+簇代表代謝活性的iPSC-ECs，GJA5+簇代表動(dòng)脈樣的iPSC-ECs，APLNR+簇代表炎癥反應(yīng)性iPSC-ECs，ESM1+亞群代表活化的細(xì)胞［36］。McCracken等［37］對(duì)兩個(gè)分化方案來(lái)源的人胚胎干細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞（esc-ec）進(jìn)行了scRNA-seq分析。擬時(shí)間分析顯示分化第6天開(kāi)始分化為內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞類型，這兩種細(xì)胞類型在分化第8天開(kāi)始成熟，以間充質(zhì)細(xì)胞群中SNAI2表達(dá)減少，內(nèi)皮細(xì)胞中ANGPT2、ESM1和GNG11表達(dá)增加為顯著特征。盡管ESC-ECs在最初的內(nèi)皮命運(yùn)決定后進(jìn)一步成熟，但沒(méi)有觀察到器官特異性內(nèi)皮標(biāo)記基因表達(dá)。未來(lái)的研究應(yīng)該集中在進(jìn)一步優(yōu)化分化方案以產(chǎn)生組織特異的成熟ECs。

6 scRNA-seq測(cè)序技術(shù)與心肌梗死與再生

Gladka等［38］對(duì)小鼠心梗缺血-再灌注模型進(jìn)行心臟單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在各種細(xì)胞類型中出現(xiàn)了以前未知的細(xì)胞亞群，尤其是鑒定出一群Ckap4表達(dá)增加的成纖維細(xì)胞群。冷凍損傷斑馬魚(yú)心臟交界區(qū)心肌細(xì)胞的scRNA-seq顯示，損傷后交界區(qū)心肌細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與胚胎心肌細(xì)胞相似，這解釋了在斑馬魚(yú)心臟再生過(guò)程中觀察到的小梁心肌細(xì)胞向皮質(zhì)心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)換，從而產(chǎn)生了小梁細(xì)胞和皮質(zhì)細(xì)胞［39］。為了研究心肌梗死后新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的異質(zhì)性，從內(nèi)皮特異性譜系追蹤的梗死7 d后小鼠心臟中分離的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，鑒定出的10個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞簇中，其中有5個(gè)簇在心肌梗死后組顯著富集，這些簇中與心臟重塑、內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用、增殖和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。其中Plvap在心肌梗死小鼠模型和人類心臟模型的這5個(gè)簇中的3個(gè)中高表達(dá)，且僅局限于梗死邊緣區(qū)的內(nèi)皮細(xì)胞［39］，與梗死后促進(jìn)內(nèi)源性心臟組織修復(fù)的生長(zhǎng)因子的定位相同［40］。類似的，心肌梗死后7 d的每個(gè)非心肌細(xì)胞群體都有自己的中間過(guò)渡狀態(tài)和獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄信號(hào)，越來(lái)越多的研究已經(jīng)使用scRNA-seq來(lái)闡明心肌梗死后各種非心肌細(xì)胞群體的作用，促進(jìn)了人們對(duì)缺血組織重建過(guò)程中微環(huán)境變化的理解。未來(lái)的研究將受益于對(duì)這些細(xì)胞類型和過(guò)渡狀態(tài)的特定功能的更深入的機(jī)制研究，特別是在損傷后的不同階段，如早期急性炎癥（梗死后1 d）和晚期重塑（梗死后30 d）。這樣的研究將允許更好地描述病理性心臟纖維化期間內(nèi)皮細(xì)胞到間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變或間質(zhì)細(xì)胞到內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)特征。目前，非心肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞之間在組織修復(fù)和重塑過(guò)程中的細(xì)胞間通訊的轉(zhuǎn)錄研究和隨后的驗(yàn)證還沒(méi)有得到充分的研究，填補(bǔ)這些知識(shí)的空白對(duì)于提高人們對(duì)心臟損傷和修復(fù)不同階段所涉及的細(xì)胞反應(yīng)的理解至關(guān)重要。

7 scRNA-seq測(cè)序技術(shù)與先天性心臟畸形以及心衰

Nkx2.5是心臟早期發(fā)生重要的轉(zhuǎn)錄因子［41］，其顯性突變會(huì)導(dǎo)致房間隔缺損［42］，DeLaughter等［24］利用Nkx2.5+/-單倍型不足的小鼠心肌單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)心肌和內(nèi)皮的成熟都推遲了，推測(cè)心肌對(duì)心內(nèi)膜的分化至關(guān)重要。而Li等［23］發(fā)現(xiàn)Nkx2.5-/-胚鼠心肌直接丟失了心室的轉(zhuǎn)錄譜，轉(zhuǎn)錄異常，沒(méi)有心室的表型，只能表現(xiàn)出左房心肌的表型。致密化心室肌特異表達(dá)MYH7，而MYH7突變?cè)谛募≈旅芑蝗凶畛Ｒ?jiàn)［43］，可能為心肌致密化不全好發(fā)于左心室游離壁提供了一定的解釋［5］。此外，發(fā)現(xiàn)人第7周的心內(nèi)膜高表達(dá)配體NRG1，他們的受體ERBB2和ERBB4高表達(dá)在小梁肌，但很少有細(xì)胞表達(dá)BMP10，暗示這一時(shí)期心內(nèi)膜通過(guò)NOTCH信號(hào)通路調(diào)節(jié)心肌致密化主要是是通過(guò)ERBBs信號(hào)來(lái)促進(jìn)分化，而不是通過(guò)BMP10誘導(dǎo)的增殖［44］，這與先前從小鼠研究中發(fā)現(xiàn)基因Bmp10的突變與胚胎發(fā)生過(guò)程中心肌致密化不全的發(fā)展密不可分提出了不同見(jiàn)解［45］，當(dāng)然這也不排除是物種間的差異。GATA6突變導(dǎo)致永存動(dòng)脈干、法洛四聯(lián)癥等動(dòng)脈畸形［46-47］，而GATA6調(diào)控晚期心肌發(fā)育［5］，這之間也尚待研究。此外房性心律失常相關(guān)基因PITX2則在左心房高表達(dá)［5］，是否暗示房性心律失常異位起搏點(diǎn)多發(fā)生左心房，還需進(jìn)一步研究。有研究報(bào)道MYH6是病竇綜合征［48］的易感基因，而MYH6在致密化心房肌中特異表達(dá)，研究致密化心房肌對(duì)臨近的竇房結(jié)的信號(hào)通路可能是找出其中原因的一個(gè)方向。Gollob等［49］發(fā)現(xiàn)GJA5是房顫的重要致病基因，而GJA5特異表達(dá)在小梁肌。此外，細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)異常與心衰相關(guān)，目前單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)不僅主要來(lái)源成纖維細(xì)胞，心肌和其他類型心臟細(xì)胞也會(huì)分泌細(xì)胞外基質(zhì)，且心肌隨著細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)增加而不斷成熟，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的研究可能是闡明心衰相關(guān)疾病機(jī)制的一個(gè)方向。Nomura等［50］在單細(xì)胞水平鑒定出肥厚型心肌病心肌特異轉(zhuǎn)錄譜。其中值得注意的是，基于擬時(shí)分析，在DNA氧化損傷積累后，P53依賴的Mef2Nrf2信號(hào)軸在促進(jìn)肥厚心肌細(xì)胞致病基因激活方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步被來(lái)自心力衰竭患者的心肌細(xì)胞scRNAseq獲得的數(shù)據(jù)所證實(shí)［50］。

8 結(jié)語(yǔ)與展望

本文概述了scRNA-seq技術(shù)在胚胎心臟發(fā)育、心臟細(xì)胞的異質(zhì)性以及在心血管方面、多能干細(xì)胞分化心血管和心臟疾病方面的進(jìn)展。

在胚胎心臟細(xì)胞的異質(zhì)性方面，至今也還沒(méi)有分出淋巴內(nèi)皮和起搏整個(gè)心臟的竇房結(jié)細(xì)胞群。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有報(bào)道說(shuō)淋巴內(nèi)皮具有引導(dǎo)血管內(nèi)皮再生功能，這對(duì)心梗之后心臟再生血管重建可能也有重要的意義［51］。而分化出人的竇房結(jié)起搏細(xì)胞代替心臟起搏器有很大的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值，但竇房結(jié)區(qū)域小，缺乏明確形態(tài)標(biāo)記，異質(zhì)性高，有大比例的心房細(xì)胞和非起搏細(xì)胞，從而需要設(shè)計(jì)出更巧妙的實(shí)驗(yàn)捕獲到足量純化的竇房結(jié)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。

在心臟再生方面，人類成體心肌再生能力有限，而在心肌有再生能力的動(dòng)物模型上，梗死區(qū)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)是原位的單細(xì)胞測(cè)序到的免疫細(xì)胞［5］，還是通過(guò)淋巴管，血管趨化而來(lái)還需進(jìn)一步研究。此后心肌細(xì)胞增殖顯著上升，成纖維細(xì)胞參與了心肌梗死后的纖維疤痕過(guò)程［52］，可以借助scRNA-seq技術(shù)鑒別哪種亞型的成纖維細(xì)胞參與了這一過(guò)程。此外，前期研究認(rèn)為TBX18陽(yáng)性的心外膜可以作為心臟前體細(xì)胞產(chǎn)生心肌細(xì)胞［53］，單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果也顯示其作為心臟前體細(xì)胞有心臟發(fā)育的潛能［5，26］。目前，成體干細(xì)胞，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，細(xì)胞重編程，心臟組織工程［54］等心肌再生的方法都已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)中，但仍沒(méi)有突破性成果，希望單細(xì)胞測(cè)序分析進(jìn)一步了解心肌再生機(jī)制，找到最適于再生的心肌細(xì)胞亞型及其核心轉(zhuǎn)錄因子，分化或者原位將成纖維細(xì)胞重編程成成熟有功能的心肌細(xì)胞。

除了心臟再生，先天性心臟病也亟待單細(xì)胞測(cè)序進(jìn)一步研究，如已知神經(jīng)嵴細(xì)胞與很多先天性心臟病相關(guān)，需要進(jìn)一步通過(guò)Smart-seq2等scRNA-seq技術(shù)進(jìn)一步測(cè)序研究。此外，還可以對(duì)先天性心臟病流產(chǎn)胎兒心臟組織單細(xì)胞測(cè)序，然后與現(xiàn)有正常流產(chǎn)胎兒數(shù)據(jù)作比較，發(fā)現(xiàn)可能致病機(jī)制。

最后考慮到不同患者在心血管疾病藥物治療反應(yīng)上的顯著差異，通過(guò)普通轉(zhuǎn)錄組也只能發(fā)現(xiàn)iPSCCMs對(duì)常見(jiàn)心血管藥物轉(zhuǎn)錄組譜整體上存在人際差異，卻無(wú)法鑒別出靶細(xì)胞群之間藥物敏感性差異。在治療前基于scRNA-seq技術(shù)得到的細(xì)胞異質(zhì)性的評(píng)估，可以為醫(yī)生確定最有效的、個(gè)性化的治療方案提供依據(jù)。