辛國(guó)芹， 汪祥燕， 孟凡進(jìn)， 寧慧宇， 徐海燕*， 谷巍

（1.山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東泰安271000；2.壽光市文家街道畜牧獸醫(yī)工作站，山東壽光 262712）

乳酸菌是一種安全、優(yōu)質(zhì)、高效的益生菌，具有良好的生物學(xué)特性，可以調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群平衡，增強(qiáng)免疫力，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育，提高飼料轉(zhuǎn)化率，并具有改善飼養(yǎng)環(huán)境和環(huán)境污染的獨(dú)特作用。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第1126號(hào)公告中允許使用的飼料微生物添加劑有16種，其中乳酸菌有11種，占68%左右（汪孟娟等，2014）。目前應(yīng)用于飼料添加劑的乳酸菌主要有植物乳桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌等（Predigon，2013；趙紅霞等，2013）。高密度培養(yǎng)是近幾年來(lái)發(fā)酵工藝的重要目標(biāo)與方向之一，細(xì)胞高密度培養(yǎng)（HCDF）是指在一定的培養(yǎng)條件和體系內(nèi)，在不影響胞內(nèi)產(chǎn)物積累的基礎(chǔ)上，盡可能多的積累生物量（鄭雙鳳等，2017），乳酸菌要通過(guò)高密度培養(yǎng)技術(shù)達(dá)到理想的高濃度產(chǎn)量，需要優(yōu)化一系列相關(guān)的工藝參數(shù)來(lái)對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行嚴(yán)格的控制。除此之外，乳酸菌發(fā)酵液后處理工藝也是乳酸菌菌粉制備的重要一環(huán)，如果離心條件掌握不當(dāng)，菌體死亡率和損失率會(huì)隨之增高，故而選用合適的離心條件是非常必要的（白景隆，2006），諸多菌粉制作技術(shù)中，真空冷凍干燥法生產(chǎn)的發(fā)酵劑由于具有含活菌數(shù)高、發(fā)酵活力強(qiáng)、遺傳性穩(wěn)定、便于儲(chǔ)藏、攜帶方便、使用安全等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用（喬發(fā)東等，1998）。凍干保護(hù)劑是凍干工藝過(guò)程中最為關(guān)鍵的因素之一，其不僅影響菌粉在凍干過(guò)程中的細(xì)胞存活率，也影響保藏期間的細(xì)胞穩(wěn)定性（張英華等，2005），所以凍干保護(hù)劑的篩選是采用凍干法制備高活菌數(shù)乳酸菌制品研究的技術(shù)關(guān)鍵（陳聲明等，1996）。

乳酸菌產(chǎn)品效果優(yōu)異，安全性高，在市場(chǎng)中廣受好評(píng)，但是儲(chǔ)存過(guò)程存活率下降迅速的問(wèn)題一直困擾著廣大用戶，本研究在現(xiàn)有乳酸菌生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)速、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液pH調(diào)控、發(fā)酵時(shí)間、凍干保護(hù)劑等方面進(jìn)行中試優(yōu)化，從技術(shù)和經(jīng)濟(jì)角度提高乳酸菌發(fā)酵液及菌粉活菌數(shù)，同時(shí)簡(jiǎn)化操作步驟、降低各類含乳酸菌產(chǎn)品的成本、增強(qiáng)產(chǎn)品穩(wěn)定性，為其實(shí)現(xiàn)工業(yè)化、研制動(dòng)物微生態(tài)制劑產(chǎn)品奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種 植物乳桿菌BLPS-9，由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司菌種保藏中心保存。

1.2 培養(yǎng)基 TM：糖蜜1.0%、葡萄糖1.0%、檸檬酸三銨0.2%、乙酸鈉0.5%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀0.5%、硫酸錳0.02%、硫酸鎂0.05%、蛋白胨1.0%、牛肉膏 1.0%、吐溫 80 0.1%，pH 6.5。

1.3 試驗(yàn)器材 精密pH計(jì)：PHS-3C，上海雷磁；紫外分光光度計(jì)：UNLC UV-2000，尤尼柯（上海）儀器有限公司；全自動(dòng)高壓滅菌器：LMQ.C-80K，新華牌；超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2F，江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司；真空冷凍干燥機(jī)：FDU1100，山東愛(ài)博科技有限公司；低溫臺(tái)式高速離心機(jī)：Thermo Fisher；電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHP-9082，bluepard；500 L發(fā)酵罐：KRH-BPJ50/500，江蘇科海生物工程設(shè)備有限公司。

1.4 乳酸菌中試（500 L）發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.4.1 發(fā)酵時(shí)間的選擇 接種量：2%；培養(yǎng)溫度：37℃；罐壓保持在0.05 Mpa，不通氣；檢測(cè)指標(biāo)：接種至500 L發(fā)酵罐，30℃培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，檢測(cè)發(fā)酵液活菌數(shù)、OD600值、pH，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4.2 培養(yǎng)溫度的選擇 罐壓保持在0.05 Mpa，不通氣，分別選擇 30、37、42℃培養(yǎng) 20 h，檢測(cè)發(fā)酵液活菌數(shù)及pH。

1.4.3 攪拌最佳條件優(yōu)化 罐壓保持在0.05 Mpa，不通氣，2%接種量，采用不攪拌、轉(zhuǎn)速100、200、300 r/min條件下培養(yǎng)適宜時(shí)間，取樣測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)。

1.4.4 發(fā)酵液pH調(diào)控對(duì)活菌數(shù)的影響 罐壓保持在0.05 Mpa，不通氣，2%接種量，使用一定濃度的NaOH溶液，調(diào)整發(fā)酵液pH維持在5.0、6.0、7.0，培養(yǎng)20 h，測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)。

1.5 乳酸菌發(fā)酵液離心條件的篩選 離心條件的選擇：分別選擇不同的轉(zhuǎn)速和時(shí)間對(duì)等體積同批次發(fā)酵液進(jìn)行離心，然后通過(guò)測(cè)離心前后活菌數(shù)存活率來(lái)確定收集高濃度菌體所需要的離心條件。離心條件如表1所示。

表1 乳酸菌發(fā)酵液離心條件篩選

懸浮液制備：準(zhǔn)確稱取2 L發(fā)酵液體經(jīng)不同離心條件離心收集菌體，用0.9%滅菌生理鹽水重懸至 20 mL，進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定。

活菌數(shù)的測(cè)定：吸取1 mL待測(cè)菌液用滅菌的生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇適當(dāng)?shù)南♂屘荻?，吸? mL菌懸液置于平板內(nèi)，加入15 mL左右的MRS培養(yǎng)基混勻，每個(gè)稀釋梯度3個(gè)平行。平板在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，選擇菌落數(shù)為30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

存活率/%=M1×V1/M2×V2×100；

式中：M1、M2分別為菌懸液及發(fā)酵液活菌；V1、V2分別為菌懸液及發(fā)酵液體積。

1.6 乳酸菌凍干保護(hù)劑的篩選

1.6.1 凍干保護(hù)劑的篩選 選定脫脂奶粉、海藻糖及甘油進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。

表2 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)%

1.6.2 冷凍干燥存活率的測(cè)定 取相同體積的菌懸液按比例添加不同組合的保護(hù)劑，相同條件下進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥后制粒，準(zhǔn)確稱取1 g菌粉置于99 mL滅菌生理鹽水中，振蕩均勻，制備菌懸液，其余同上。凍干存活率計(jì)算公式為（Lijin Huang 等，2006）：

存活率/%=樣品凍干后的活菌數(shù)/凍干前的活菌數(shù)×100。

1.7 植物乳桿菌菌粉貯存穩(wěn)定性研究 最佳發(fā)酵及后處理工藝條件下制備的菌粉以糊精作為載體稀釋至2×1011cfu/g，分別置于4、-20℃條件下進(jìn)行貯存，每7 d進(jìn)行取樣測(cè)活菌數(shù)，試驗(yàn)周期維持28 d；活菌數(shù)測(cè)定方法如上所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌中試（500 L）發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間的選擇 如表3所示，發(fā)酵至20 h時(shí)發(fā)酵液活菌數(shù)最高為57×108cfu/mL，此時(shí)發(fā)酵液pH為3.44，培養(yǎng)至32 h時(shí)活菌數(shù)下降一個(gè)數(shù)量級(jí)，選擇培養(yǎng)20 h做為發(fā)酵終點(diǎn)。

表3 菌株BLPS-9生長(zhǎng)曲線

2.1.2 培養(yǎng)溫度的選擇 如表4所示，37℃培養(yǎng)20 h，發(fā)酵液pH最低為3.59，發(fā)酵液活菌數(shù)最高為55×108cfu/mL，后續(xù)發(fā)酵選擇37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

表4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)的影響

2.1.3 攪拌最佳條件優(yōu)化 如表5所示，轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為58×108cfu/mL，不攪拌條件下發(fā)酵液活菌數(shù)較低，僅為30×108cfu/mL，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基成分沉于罐底，不利于菌株的發(fā)酵生長(zhǎng)，后續(xù)發(fā)酵選擇以100 r/min攪拌培養(yǎng)。

表5 不同攪拌速度對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)的影響

2.1.4 發(fā)酵液pH調(diào)控對(duì)活菌數(shù)的影響 如表6所示，調(diào)整發(fā)酵液維持在6.0活菌數(shù)最高，為64×108cfu/mL，較自然pH下活菌數(shù)高52.38%，發(fā)酵液pH維持在5.0時(shí)活菌數(shù)為46×108cfu/mL，較自然pH活菌數(shù)高9.5%，確定發(fā)酵液pH持續(xù)維持在6.0活菌數(shù)最高。乳酸菌的重要特性就是能夠分解糖類物質(zhì)產(chǎn)生乳酸。隨著細(xì)菌的增殖，培養(yǎng)基的pH會(huì)不斷降低，在培養(yǎng)乳酸菌的時(shí)候培養(yǎng)基的pH會(huì)降低到5以下（陳紅梅，2008）。因而在發(fā)酵液中加入一定的緩沖物質(zhì)，能更好的緩解pH的降低，且其活菌量也較高。這與其他的報(bào)道（呂兵等，2001）通過(guò)緩解pH方式來(lái)實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)的結(jié)果一致。

表6 發(fā)酵液pH調(diào)控對(duì)活菌數(shù)的影響

2.2 離心條件的篩選 如表7所示，以10000 r/min離心10 min菌懸液活菌數(shù)及存活率最高，分別為5.44×1011cfu/mL、92.25%。 離心轉(zhuǎn)速越低、時(shí)間越短效果越不理想，菌體會(huì)隨上清液流失；由于離心力的作用，轉(zhuǎn)速越高時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)造成菌體的機(jī)械損傷而死亡。如果離心條件不適，必然導(dǎo)致發(fā)酵劑中活菌含量的下降。本試驗(yàn)所得結(jié)果與田洪濤（1998）所報(bào)道的“低速長(zhǎng)時(shí)”或“高速短時(shí)”離心收獲的活菌數(shù)最多基本一致。

2.3 凍干保護(hù)劑的篩選 采用3因素3水平的正交試驗(yàn) L9（33）確定脫脂奶粉、海藻糖和甘油的復(fù)合配方，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 8和表9。

表7 不同轉(zhuǎn)速及離心時(shí)間對(duì)菌懸液活菌數(shù)的影響

表8 植物乳桿菌凍干保護(hù)劑的篩選

表9 植物乳桿菌最佳凍干保護(hù)劑組合的篩選%

不同凍干保護(hù)劑對(duì)植物乳桿菌BLPS-9凍干存活率影響順序?yàn)锳＞B＞C，即脫脂奶粉對(duì)凍干存活率影響最大，甘油最小。經(jīng)優(yōu)化后植物乳桿菌BLPS-9的最佳凍干保護(hù)劑配方為A3B2C3。即脫脂奶粉25%、海藻糖7.5%、甘油0.75%。經(jīng)查表格設(shè)計(jì)中并無(wú)此項(xiàng)，選定凍干存活率較高的組別A3B2C1及A3B3C2做參照，針對(duì)最佳凍干保護(hù)劑組合進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果如下：

如表9所示，最佳凍干保護(hù)劑組合A3B2C3即脫脂奶粉25%、海藻糖7.5%、甘油0.75%條件下植物乳桿菌BLPS-9活菌存活率為91.01%，高于A3B2C1的88.14%，除卻計(jì)數(shù)誤差，活菌數(shù)可達(dá)6.0×1011cfu/g。

2.4 植物乳桿菌菌粉貯存穩(wěn)定性研究 如表10所示，植物乳桿菌BLPS-9菌粉在不同條件下貯存，除卻計(jì)數(shù)誤差，在4℃和-20℃條件下貯存28 d菌粉活菌數(shù)無(wú)明顯變化，存活率仍能超過(guò)90%。

表10 不同貯存條件下植物乳桿菌菌粉活菌數(shù)變化 ×108cfu/g

3 結(jié)論

3.1 中試發(fā)酵工藝條件優(yōu)化 采用實(shí)驗(yàn)室條件下乳酸菌最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行（BLPS-9）500 L發(fā)酵罐中試試驗(yàn)，篩選的最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度37℃、轉(zhuǎn)速100 r/min、不通氣、罐壓維持0.05 Mpa、調(diào)控發(fā)酵液pH 5.5左右培養(yǎng)20 h，發(fā)酵液活菌數(shù)維持在50×108cfu/mL以上。

3.2 發(fā)酵液最佳離心條件的篩選 通過(guò)研究離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間對(duì)植物乳桿菌BLPS-9發(fā)酵液活菌數(shù)的影響，確定最佳離心條件為10000 r/min、10 min，濃縮100倍菌懸液活菌數(shù)可達(dá)5.44×1011cfu/mL。

3.3 凍干保護(hù)劑篩選 通過(guò)正交試驗(yàn)篩選確定最佳凍干保護(hù)劑配方：脫脂奶粉25%、海藻糖7.5%、甘油0.75%，采用此凍干保護(hù)劑植物乳桿菌BLPS-9凍干存活率可達(dá)91.01%，凍干粉活菌數(shù)可達(dá) 6×1011cfu/g。

3.4 菌粉貯存穩(wěn)定性研究 以糊精為載體稀釋植物乳桿菌BLPS-9菌粉至2×1010cfu/g，在不同條件下貯存，除卻計(jì)數(shù)誤差，在4℃和-20℃條件下貯存28 d菌粉活菌數(shù)無(wú)明顯損失，可一定程度上提高乳酸菌產(chǎn)品的貨架期。