王永鋒，徐焰

西安大興醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710016

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病，感染結(jié)核分枝桿菌后機(jī)體通常會(huì)產(chǎn)生一系列細(xì)胞免疫和體液免疫變化，累及全身各個(gè)器官組織[1-2]。因此，對(duì)于結(jié)核病應(yīng)盡早診斷并積極采取有效措施進(jìn)行治療。然而，結(jié)核病早期臨床癥狀并不明顯，誤診情況時(shí)有發(fā)生。目前結(jié)核病的臨床診斷仍主要依靠細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，然而其檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且涂片敏感性較差，難以區(qū)分活菌、死菌和非結(jié)核分枝桿菌，不利于肺外結(jié)核的早期診斷[3]。抗結(jié)核抗體(38kD-IgG)和結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)是近年來(lái)引入臨床檢測(cè)結(jié)核病的有效方法[4]，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。本研究通過(guò)對(duì)比38kD-IgG、T-SPOT.TB 試驗(yàn)在診斷活動(dòng)期結(jié)核病上的診斷價(jià)值，旨在為活動(dòng)期結(jié)核病的臨床診斷提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年8月至2019年11月西安大興醫(yī)院收治的141 例結(jié)核病患者進(jìn)行研究，141 例結(jié)核病患者最終確診活動(dòng)期結(jié)核病患者97 例(活動(dòng)期結(jié)核病組)，非活動(dòng)期結(jié)核病患者44 例(非活動(dòng)期結(jié)核病組)，另選擇同期在我院體檢的60 例健康志愿者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)活動(dòng)期結(jié)核病組、非活動(dòng)期結(jié)核病組患者均符合中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布的《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2017)》[5]中關(guān)于活動(dòng)性結(jié)核病和非活動(dòng)性結(jié)核病的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)對(duì)照組健康體檢者經(jīng)胸部X線(xiàn)片、生化檢測(cè)、免疫學(xué)檢查證實(shí)身體健康，無(wú)結(jié)核病史和近期結(jié)核患者密切接觸史者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有心腦血管疾病，造血系統(tǒng)疾病以及肝、腎等重要臟器有嚴(yán)重器質(zhì)性病變者；(2)有免疫抑制劑用藥史、放化療治療史者?；顒?dòng)期結(jié)核病組中男性61 例，女性36例；年齡27～74歲，平均(47.38±6.19)歲；活動(dòng)期肺結(jié)核61 例，活動(dòng)期結(jié)核性胸膜36 例。非活動(dòng)期結(jié)核病組中男性 28 例，女性 16 例；年齡 25～71 歲，平均(47.45±6.21)歲。對(duì)照組中男性37例，女性23例；年齡24～73歲，平均(47.41±6.33)歲。三組受檢者的性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者家屬知情并同意簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 外周血T-SPOT.TB 檢測(cè)及陽(yáng)性判定 本研究的T-SPOT.TB 試劑盒購(gòu)自上海復(fù)星高科技有限公司，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：入院后，采集各組受檢者的5 mL 外周靜脈血置于真空肝素鈉抗凝管中，采用Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)。在抗INF-γ抗體預(yù)包被的細(xì)胞計(jì)數(shù)板中加入AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)液、B抗原濾液培養(yǎng)蛋白10(CFP10)、A 抗原早期分泌性靶抗原6(ESAT6)各50 μL，同時(shí)加入50 μL 細(xì)胞培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，放置在37℃5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h。取出培養(yǎng)板中舍棄孔內(nèi)液體，清洗干凈后在孔內(nèi)加入50 μL新鮮酶標(biāo)抗體溶液，于2℃～8℃下培養(yǎng)1 h，之后再加入50 μL 底物溶液，在室溫條件下顯色反應(yīng)7 min，經(jīng)蒸餾水清洗后進(jìn)行干燥處理，采用ELISPOT自動(dòng)計(jì)數(shù)儀進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。

依據(jù)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)確定檢測(cè)結(jié)果：陰性對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)≤5 個(gè)，ESAT6 或 CFP10 斑點(diǎn)數(shù)-陰性對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)＞7 個(gè)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陰性；陰性對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)＞5個(gè)，ESAT6或CFP10 斑點(diǎn)數(shù)-陰性對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)≥陰性對(duì)照組斑點(diǎn)數(shù)的兩倍時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

1.2.2 38kD-IgG檢測(cè)及陽(yáng)性判定 各組受試者在入院后采用真空肝素鈉抗凝管采集外周靜脈血5 mL，迅速混勻后在最短時(shí)間內(nèi)采用玻璃棒剝離纖維蛋白，以確保血液標(biāo)本無(wú)渾濁沉淀，以防止吸入堵塞反應(yīng)膜孔。采用斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)(DIGFA)原理檢測(cè)血清標(biāo)本中的38kD-IgG，試劑盒購(gòu)自濰坊市康華生物技術(shù)有限公司，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。該試劑中的結(jié)核分枝桿菌能夠捕獲血清中的含結(jié)核IgG抗體，與葡萄球菌A蛋白(SPA)結(jié)合形成特異性紅色斑點(diǎn)，若檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組受檢者的T-SPOT.TB、38kD-IgG試驗(yàn)陽(yáng)性率比較 活動(dòng)期結(jié)核病組患者的T-SPOT.TB 陽(yáng)性率和38kD-IgG陽(yáng)性率分別為90.72%、74.23%，明顯高于非活動(dòng)期結(jié)核病組的77.27%、54.55%和對(duì)照組的8.33%、6.67%，非活動(dòng)期結(jié)核病組的T-SPOT.TB 陽(yáng)性率和38kD-IgG陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三組受檢者的T-SPOT.TB、38kD-IgG試驗(yàn)陽(yáng)性率比較[例(%)]

2.2 T-SPOT.TB、38kD-IgG試驗(yàn)對(duì)活動(dòng)期結(jié)核病的診斷效能比較 T-SPOT.TB試驗(yàn)在診斷活動(dòng)期結(jié)核病上的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度以及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值明顯高于38kD-IgG試驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 活動(dòng)期結(jié)核病組和非活動(dòng)期結(jié)核病組患者的T-SPOT.TB 斑點(diǎn)計(jì)數(shù)比較 兩組患者的ESAT6 斑點(diǎn)計(jì)數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；活動(dòng)期結(jié)核病組患者的CFP10、ESAT6 合并CFP10 斑點(diǎn)計(jì)數(shù)明顯高于非活動(dòng)期結(jié)核病組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表2 T-SPOT.TB、38kD-IgG試驗(yàn)診斷活動(dòng)期結(jié)核病的效能比較(%)

表3 活動(dòng)期結(jié)核病組和非活動(dòng)期結(jié)核病組患者的T-SPOT.TB斑點(diǎn)計(jì)數(shù)比較

表3 活動(dòng)期結(jié)核病組和非活動(dòng)期結(jié)核病組患者的T-SPOT.TB斑點(diǎn)計(jì)數(shù)比較

例數(shù)88 34組別活動(dòng)期結(jié)核病組非活動(dòng)期結(jié)核病組t值P值ESAT6 24.33±6.29 22.92±6.71 1.090 0.278 CFP10 60.46±13.84 41.27±9.38 7.442 0.001 ESAT6合并CFP10 86.24±20.92 68.31±18.33 4.387 0.001

3 討論

結(jié)核分枝桿菌感染及嚴(yán)重程度與結(jié)核分枝桿菌的毒性、數(shù)量以及自身免疫等因素有關(guān)[6]。一般情況下，機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后處于潛伏狀態(tài)，體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌處于靜止?fàn)顟B(tài)；機(jī)體免疫功能下降時(shí)，體內(nèi)的結(jié)核分歧桿菌由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S狀態(tài)，此時(shí)潛伏感染則轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒?dòng)期結(jié)核病[7-8]。早期診斷和治療對(duì)于減少和控制結(jié)核病的發(fā)展和傳播具有重要意義。

T-SPOT.TB 試驗(yàn)、38kD-IgG 試驗(yàn)作為近年來(lái)興起的結(jié)核病檢查手段，在臨床上應(yīng)用廣泛[9]。本研究結(jié)果顯示，活動(dòng)期結(jié)核病患者的T-SPOT.TB 陽(yáng)性率和38kD-IgG 陽(yáng)性率分別為90.72%、74.23%，均明顯高于非活動(dòng)期結(jié)核病患者健康體檢者(分別為77.27%、54.55%和8.33%、6.67%)，非活動(dòng)期結(jié)核病組的T-SPOT.TB 陽(yáng)性率和38kD-IgG 陽(yáng)性率均明顯高于健康體檢者。結(jié)果說(shuō)明T-SPOT.TB試驗(yàn)、38kD-IgG試驗(yàn)在臨床診斷具有一定應(yīng)用價(jià)值。

38kD-IgG 試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)純化結(jié)核分枝桿菌胞壁蛋白38kD抗原檢測(cè)血液中相應(yīng)的IgG抗體，進(jìn)而能夠?qū)w內(nèi)是否存在結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行判斷[10]。由于38kD-IgG抗體是一種免疫顯性分泌蛋白，在其他分枝桿菌中也廣泛存在，交叉反應(yīng)較高；另外，38kD-IgG抗體通常出現(xiàn)在結(jié)核病中晚期，早期檢測(cè)可能會(huì)出現(xiàn)假陰性[11]。因此在一定程度上限制了38kD-IgG 試驗(yàn)在診斷活動(dòng)期結(jié)核病中的應(yīng)用。

結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)以γ-干擾素釋放試驗(yàn)為基礎(chǔ)，通過(guò)檢測(cè)單細(xì)胞上的結(jié)核分枝桿菌判斷疾病[12]，其使用的ESAT6、CFP10二種特異性抗原主要集中在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，與絕大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌及卡介苗都沒(méi)有交叉反應(yīng)[13-14]，因此具有較高的敏感性和特異性，且不受機(jī)體免疫狀態(tài)影響。本研究結(jié)果顯示，T-SPOT.TB 試驗(yàn)在診斷活動(dòng)期結(jié)核病上的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度以及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為90.72%、77.27%、86.52%、89.90%和79.07%，均明顯高于38kD-IgG 試驗(yàn)的74.23%、54.55%、68.09%、78.26%和48.98%，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符。另外，在T-SPOT.TB 試驗(yàn)中，每個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)致敏的T 淋巴細(xì)胞，斑點(diǎn)數(shù)目的增加能夠在一定程度上代表結(jié)核病的活動(dòng)程度[15-16]。本研究結(jié)果顯示，活動(dòng)期結(jié)核病組患者的CFP10、ESAT6 合并CFP10 斑點(diǎn)計(jì)數(shù)均明顯高于非活動(dòng)期結(jié)核病組患者。因此，通過(guò)觀察患者的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，能夠在一定程度上體現(xiàn)結(jié)核病患者的活動(dòng)程度。

綜上所述，T-SPOT.TB 試驗(yàn)在診斷活動(dòng)期結(jié)核病上較38kD-IgG 試驗(yàn)更加敏感、準(zhǔn)確，對(duì)于排除非活動(dòng)期結(jié)核病、減少不必要的抗結(jié)核治療具有重要意義。另外，結(jié)核病的活動(dòng)性隨著T-SPOT.TB試驗(yàn)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)的增加而增加，因此T-SPOT.TB試驗(yàn)在評(píng)估活動(dòng)期結(jié)核病嚴(yán)重程度上也能夠發(fā)揮一定作用。