伍銀環(huán)，劉弘鋅，呂遠平，鄧銳杰

(四川大學輕工科學與工程學院，四川 成都 610065)

赭曲霉毒素(Ochratoxin)是曲霉菌屬和青霉菌屬的某些菌種通過一系列代謝活動所產(chǎn)生，是目前引起世界廣泛關注的霉菌毒素之一[1].它包含7種結構相似的化合物，它的基本結構為苯甲酸異香豆素[2].這7中結構中屬赭曲霉毒素A(OTA)的毒性最大、范圍最廣、產(chǎn)毒量最高、對農(nóng)產(chǎn)品存在嚴重污染，廣泛存在于谷物以及飼料當中，與人類的健康密切相關[3-4].OTA對大多數(shù)哺乳動物具有肝毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性、致畸性和致突變性[5].更糟糕的是，OTA可能會污染許多食物和飲料，如谷類食品、堅果、咖啡、啤酒和葡萄酒[6-7].OTA還具有極強的化學穩(wěn)定性，在溫度高于250℃時才會發(fā)生分解[8].歐盟規(guī)定在成人食用的谷物中OTA的含量不能超過3μg·kg-1，用于嬰幼兒食用以及特殊醫(yī)療目的食品的谷物中OTA含量不能超過0.5μg·kg-1[9].我國食品安全標準規(guī)定谷物原料中OTA含量不能超過5μg·kg-1，飼料中OTA不得高于100μg·kg-1[10].因此，發(fā)展快速、靈敏的OTA檢測方法對于保障食品安全和人類健康具有重要意義.高效液相色譜(HPLC)以及其質譜聯(lián)用技術是目前OTA檢測的標準方法，具有準確度和可靠性高等特點，但是由于依賴大型儀器，無法應用于現(xiàn)場檢測.近年來，發(fā)展的酶聯(lián)免疫方法以及包括表面等離子體共振(SPR)和電化學免疫等新型傳感方法有望用于OTA污染的現(xiàn)場檢測.然后這些方法大部分依賴分離過程，且利用抗體的檢測方法受限于抗體的穩(wěn)定性，價格也比較昂貴.因此，建立一種操作簡便，耗時短成本低的檢測手段對OTA的檢測是至關重要的(表1).

表1 OTA檢測方法對比Table 1 Comparison of OTA detection methods

石墨烯是一種二維納米材料，具有獨特的碳六元環(huán)晶體結構[11].氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是石墨烯的一種衍生物，其表面有很多具有較強親水活性的含氧官能團，比如羥基和羧基，這些基團使氧化石墨烯能夠均勻地分散在水相中，具有良好的水溶性[12-13].GO以其優(yōu)異的電子、機械、表面功能、水分散性和增強熒光猝滅能力[14]等性能在生物領域受到越來越多的關注同時，GO表面具有大量的π-π分子結構，能夠使核酸鏈很好的吸附在GO的表面，故而可以作為熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)的受體[15-18].此外，GO還可以結合單鏈DNA(ssDNA)在堿基和GO之間通過疏水、氫鍵和小分子疊置相互作用發(fā)生[19-20].然而，它幾乎不能與剛性雙鏈DNA(dsDNA)或良好折疊的DNA相互作用DNA[21].石墨烯與DNA的特異性相互作用可以用于構建光學、電學和比色傳感器.

核酸適配體又稱為適配體、適配子等，一般是由幾個或幾十個核苷酸組成的單鏈DNA或者RNA序列，可以通過經(jīng)典的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(SELEX)過程從DNA或RNA池中選擇[22-23].核酸適配體能與靶標分子實現(xiàn)高親和力和高特異性的結合.與抗體相比，核酸適配體具有篩選程序簡單、穩(wěn)定性高、成本低、活性均一、合成簡便和修飾方便等優(yōu)點[24-26].此外，相對抗體使用過程中需要固定與洗滌等復雜處理方法，核酸適配體可應用于均相檢測技術和耦合多種信號放大技術，不僅檢測方法簡單、快速，而且可實現(xiàn)更靈敏的檢測.目前基于適配體技術的均相檢測方法有比色法、熒光法等[27-28].

本研究結合靶標觸發(fā)核酸適配體構型響應及嵌入型核酸染料Eva Green，構建了一種用于OTA均相快速檢測的石墨烯核酸適配體傳感器.核酸適配體與OTA結合可改變其與石墨烯相互作用，Eva Green具有良好的穩(wěn)定性，在正常的儲存和操作中不會被破壞，它的引入可以非共價標記監(jiān)測核酸適配體與石墨烯的結合狀態(tài)，進而定量檢測OTA.在沒有OTA的情況下，由于OTA核酸適配體的發(fā)卡型結構，導致其不易吸附在GO表面[29]，故體系的熒光值較高.在體系中加入OTA后，由于OTA的存在觸發(fā)OTA核酸適配體的構型變化，發(fā)卡結構被打開從而被GO吸附，導致體系的熒光值降低.改方法只需在室溫條件下一個離心管內(nèi)混合反應即可，反應結束后可直接檢測熒光信號，其檢測動態(tài)范圍是1～10 ng·mL-1，檢出限為0.17 ng·mL-1.該方法能高特異性區(qū)分OTA與食品中的赭曲霉毒素B(OTB)及其他毒素，如:玉米赤戊烯酮(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1)等.該方法成功應用于啤酒OTA污染的檢測分析.

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與設備

OTA核酸適配體序列為GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATC(參照文獻[1]設計)，合成于擎科生物；赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)玉米赤戊烯酮毒素(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFBI)標準品購于普瑞邦生物工程有限公司(分析純)；氧化石墨烯購于先豐納米公司；Eva Green購于安諾倫(北京)生物科技有限公司公司.

熒光光譜以及熒光強度由多功能微孔板檢測儀(美國伯騰儀器有限公司)測得；黑色384微孔板(Greiner Bio-One公司)；PCR管(生工生物工程(上海)股份有限公司)；200μL吸頭(生工生物工程(上海)股份有限公司)；10μL吸頭(生工生物工程(上海)股份有限公司)；移液槍.樣品放置在384微孔板中，在波長480 nm處被激發(fā)，所有的發(fā)射光譜在室溫下從510到650 nm的波長范圍內(nèi)收集.所有實驗都在室溫下進行且至少重復三次.

1.2 實驗條件優(yōu)化

優(yōu)化的反應條件包括OTA核酸適配體、氧化石墨烯、OTA的濃度及反應時間.其中OTA核酸適配體濃度取0.1～10μM，GO濃度取1～100μg·mL-1，OTA濃度為0.1～100 ng·mL-1，反應時間為0～40 min.

1.3 熒光檢測OTA

(1)用分子級水將各試劑稀釋到一定的濃度，將4μL OTA溶液、4μL OTA核酸適配體溶液以及適量體積的水(使得反應結束時溶液終濃度為初濃度的0.1倍)加入離心管中混勻反應15 min；

(2)再向混合液中加入4μL石墨烯溶液，反應20～30 min；

(3)最后向離心管中加入4μL Eva Green后，立即將混合溶液注入到384孔板中，用多功能微孔板檢測儀對其進行熒光檢測，記錄在480 nm處的熒光值，根據(jù)實驗所得標準曲線方程式計算出OTA的濃度.

1.4 實時熒光測定

研究了時間對熒光強度變化的影響.將所有的試劑加入384微孔板中，最后加入Eva Green然后立即放入多功能微孔板檢測儀中實時測定熒光強度，檢測時間為0～40 min.

1.5 選擇性測試

為了驗證實驗所用核酸適配體的特異性，我們選擇了OTB、ZEN以及AFB1與之進行比較.首先在離心管中加入1.5μM的OTA核酸適配體、10 ng·mL-1的OTA、OTB、ZEN、AFB1，再加入適量的水，反應15 min；然后向混合液中加入25μg·mL-1的GO溶液，反應20～30 min；最后加入10×的EvaGreen后將溶液加入到384微孔板中立即用多功能微孔板檢測儀測定480 nm處的熒光值.

1.6 樣品測定

(1)樣品處理:取啤酒試樣，使用前先置于4℃冰箱冷藏30 min(低溫有利于減少樣品中的氣泡)后對其進行超聲脫氣，在室溫條件下離心10 min，使樣品中的雜質沉淀，轉速為800 rpm，離心后過濾除去沉淀，將啤酒溶液稀釋100倍，向稀釋后的啤酒溶液中加入不同濃度的OTA(1ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1).

(2)實際樣品熒光測定:將4μL含有OTA的啤酒溶液、4μL核酸適配體溶液以及適量體積的水(使得反應結束時溶液終濃度為初濃度的0.1倍)加入離心管中混勻反應15 min；再向混合液中加入4μL GO溶液，反應20～30 min；最后向離心管中加入4μL 20×Eva Green后，立即將混合溶液注入到384孔板中，用多功能微孔板檢測儀對其進行熒光檢測，記錄在480 nm處的熒光值，根據(jù)實驗所得標準曲線方程式計算出OTA的濃度.

2 結果與討論

2.1 實驗原理

基于GO和核酸適配體構建的生物傳感器檢測原理如圖1所示.通過加入嵌入式核酸染料EvaGreen，可以實現(xiàn)非共價標記核酸適配體，點亮核酸適配體探針.由于核酸適配體的發(fā)夾結構使其不容易被氧化石墨烯吸附，從而熒光不會被猝滅；當目標檢測物(OTA)存在的情況下，OTA核酸適配體在與靶結合時從發(fā)卡結構轉變?yōu)镺TA/OTA核酸適配體復合物，通過π-π共軛以及范德華力[11]，使適配體和OTA形成的復合物可吸附在氧化石墨烯的表面，由于FRET的作用，氧化石墨烯猝滅了核酸適配體和OTA/Evagreen的復合物攜帶的熒光信號，從而可由熒光值的差別來對OTA進行檢測，且檢測體系中的OTA濃度越高，熒光信號降低程度越大.

圖1 石墨烯核酸適配體傳感器用于赭曲霉毒素A的均相快速檢測原理圖Fig.1 Working principle for graphene aptasensor for rapid homogeneous detection of ochratoxin A

2.2 適配體濃度優(yōu)化

適配體的濃度為0.1～10μM，實驗結果顯示(圖2(A))，隨著核酸適配體濃度的增長，熒光強度越強，當適配體濃度為1.5μM時，背景與信號的比值(噪信比)最大，故而后續(xù)實驗適配體的濃度采用1.5μM.

圖2 原理驗證及核酸適配體優(yōu)化(A)在OTA適配體(黑色)、OTA適配體/GO(藍色)和OTA適配體/GO/OTA(紅色)存在下體系的熒光發(fā)射光譜)；(B)不同OTA適配體濃度下體系的熒光強度Fig.2 Principle verification and optimization of nucleic acid aptamer(A)Fluorescence emission spectra of the system in the presence of OTA aptamer(black)，OTA aptamer/GO(blue)and OTA aptamer/GO/OTA(red)；(B)Fluorescence intensity of the system at different OTA aptamer concentration

2.3 石墨烯濃度優(yōu)化

在熒光檢測平臺中引入GO可以得到較低的背景，而高濃度GO則可能導致熒光回收率較低.因此對GO的濃度也需要進行優(yōu)化.圖3(A)顯示了不同濃度GO存在時OTA/OTA核酸適配體的熒光信號變化.由圖可知，隨著GO的濃度增加，熒光強度不斷減弱，當GO濃度為10μg·mL-1時背景與信號的比值(噪信比)最大，比值為3.59.

2.4 實時熒光測定

研究了GO/適配體探針對靶標分子的實時響應(圖3(B)).如圖3(B)所示，熒光強度在0～20 min的時間范圍內(nèi)顯著減少，在20 min之后信號趨于穩(wěn)定.因此，選擇20 min的時間檢測OTA.

圖3 氧化石墨烯及時間的優(yōu)化(A)不同OTA適配體濃度下體系的熒光強度；(B)不同反應時間下體系的熒光強度Fig.3 Optimization of graphene oxide and time(A)Fluorescence intensity of the system at different OTA aptamer concentrations；(B)Fluorescence intensity of the system under different reaction time

2.5 標準曲線以及檢出限

方法的靈敏度是決定其適用性的關鍵參數(shù).為了評估OTA測定的靈敏度，研究了GO/適配體探針對不同濃度的OTA的響應，熒光信號如圖4(A)所示，熒光值隨著OTA濃度的增加而逐漸降低，OTA在0-10 ng·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關系(圖4(A)).檢測限為0.17 ng·mL-1，該LOD符合歐盟委員會食品法規(guī)對用于直接人食用的加工谷類產(chǎn)品中OTA的檢測要求[40].這些結果表明，該石墨烯核酸適配體傳感器有望作為一種OTA的快速現(xiàn)場檢測方法.

2.6 選擇性

為了研究該試驗方法的選擇性，選擇了與OTA結構類似的OTB及其他真菌毒素(ZEN和AFB1)進行驗證，結果如圖4(B)所示，在相同條件下，OTA引起的熒光信號變化明顯大于OTB、ZEN以及AFB1引起的信號變化.可見，由于核酸適配體對OTA的固有特異性，只有OTA才能誘導出顯著的信號.OTB、ZEN以及AFB1只引起微弱的熒光信號變化.因此，該對OTA的檢測具有良好的選擇性，表明其在復雜樣品分析中的應用具有潛在的可能性.

圖4 標準曲線及選擇性(A)不同濃度OTA條件下體系的熒光強度，濃度分別為:0，0.1，1.5，2.5，3，5，10，25，50，75，100ng·ml-1；(B)體系中OTA的選擇性Fig.4 Standard curve and selectivity(A)Fluorescence intensity of the system in the response to OTA at various concentrations:0，0.1，1.5，2.5，3，5，10，25，50，75，100 ng·mL-1；(B)Selectivity of the designed sensing system for OTA

2.7 樣品分析

為了進一步驗證所設計的測定方法在檢測食物樣本中的可行性，我們對啤酒樣品進行了OTA的加標回收實驗，用本實驗方法測定三種不同濃度OTA(1，5，10 ng·mL-1)的回收率(表2)，回收率在91.6～113%之間，驗證了該方法可應用在具有復雜基質的食品樣品中OTA的定量檢測.

表2 啤酒中OTA加標回收檢測結果Table 2 Detection of OTA in beer

3 結論

綜上所述，我們利用靶標分子觸發(fā)的核酸適配體構型變化及嵌入型核酸染料，構建了石墨烯適配體傳感器實現(xiàn)了對OTA的均相快速、非標記依賴的檢測.該方法涉及OTA觸發(fā)核酸適配體構型變化、GO的熒光淬滅能力以及核酸染料非共價標記效應.核酸適配體的結構響應性及其與GO的相互作用調(diào)控可實現(xiàn)對OTA快速靈敏的響應.與其他基于核酸適配體的OTA檢測方法相比，該方法不需要進行共價標記和帶修飾的核酸適配體，降低了成本和復雜性.該方法將OTA核酸適配體、GO與OTA樣品在室溫下簡單混合即可檢測OTA，并具有優(yōu)異的靈敏度(0.17 ng·mL-1)和選擇性.此外，該方法能夠準確檢測出啤酒中OTA的含量，并且通過選擇與其他毒素相對應的核酸適配體利用該方法可檢測其他毒素，如:黃曲霉毒素B1、卡那霉素等.因此有望為食品安全領域真菌毒素的檢測控制提供新的工具，在食品安全領域具有潛在的應用價值.