王碧霞，陳正元，澤仁達瓦，吳玉環(huán)，頓 珠，方佳敏，熊天琴

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510000；2.西藏藏醫(yī)藥大學(xué)，西藏 拉薩 850000)

藏醫(yī)作為具有2000多年歷史的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，對肝病有著獨特的認識[1]，其認為肝病誘發(fā)外因多由感受濕熱疫毒之邪所致，內(nèi)因則與患者正氣虛弱有關(guān).藏醫(yī)將肝病分為寒熱兩種，其中慢性肝病為寒性肝病，臨床表現(xiàn)為脈象遲緩，尿現(xiàn)寒象，肝端不顫，肌色青黃，肝端薄長，食欲不振，消化力下降，大便色白而稀薄等[2-3].

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)腸肝軸理論認為，腸和肝臟的關(guān)系密切.腸和肝通過多種介質(zhì)互相影響聯(lián)系，對于黃疸類疾病，膽汁酸是聯(lián)系肝腸的重要介質(zhì)，膽汁酸腸肝循環(huán)障礙是其主要特征.膽汁酸肝腸障礙，將導(dǎo)致毒性膽汁酸淤積誘發(fā)肝臟和腸道的氧化或炎癥損傷[4]，因此，改善膽汁酸肝腸循環(huán)障礙導(dǎo)致的肝腸炎癥或氧化損傷，對于肝和腸的調(diào)控具有重要意義.

藏醫(yī)在臨床實踐中已廣泛用于肝病[5]，藏方甲嘎松湯記載于《四部醫(yī)典》，由干姜、豆蔻、肉豆蔻組成，用于治療寒性肝病.前期研究表明該方可以通過調(diào)節(jié)腸肝軸穩(wěn)態(tài)對多種肝損傷動物模型具有確切的保肝作用[1，6-7].

現(xiàn)有的研究中，沒有能有效地反映臨床上寒性肝病表現(xiàn)特征的動物模型.慢性黃疸模型動物出現(xiàn)了較嚴重的膽汁淤積性肝損傷，表現(xiàn)為明顯的炎性浸潤以及膽管增生，但沒有出現(xiàn)大便稀薄的現(xiàn)象，因此擬用刺激性瀉藥番瀉葉，以模擬寒性肝病部分癥狀.基于此，本文通過在采用隔日皮下注射ANIT建立慢性黃疸模型基礎(chǔ)上，期間每日灌胃番瀉葉湯劑建立寒性肝病模型，觀察甲嘎松湯對其肝臟和腸道損傷的改善作用，初步闡明甲嘎松湯對寒性肝病模型腸肝軸的調(diào)控作用，為進一步完善腸肝軸理論以及擴大甲嘎松湯臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐.

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠，6周齡，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心(許可證號:SCXK(粵)2018-0002)，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院實驗動物中心(許可證號:SYXK(粵)2019-0202)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院實驗動物中心倫理學(xué)審查后進行實驗(廣東省實驗證明編號:00224202).

1.1.2 實驗藥物與試劑

ANIT，上海阿拉丁化科技股份有限公司，批號:N1063891；ALT/GPT試劑盒，批號:C009-2-1，AST/GOT試劑盒，批號:C010-2-1，AKP試劑盒，批號:A059-2-2，TBA試劑盒，批號:E003-2-1，TGSH/GSSG試劑盒，批號:A061-1-2，SOD試劑盒，批號:A001-3-2，MDA試劑盒，批號:A003-1-2，均購自南京建成生物工程研究所有限公司；動物RNA抽提試劑盒(離心柱式)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號:R0026；TGFβ1 mouse DuoSet Elsia kit，Bio-Techne(中國)有限公司，批號:DY1679-05；MMP2、MMP13、TIMP1、FXR、MRP2、NTCP、NQO1、HO-1和IL-10 qPCR引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Mouse IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet Elsia kit，Bio-Techne(中國)有限公司，批號:DY401；TGF-β1 mouse DuoSet Elsia kit，Bio-Techne(中國)有限公司，批號:DY1679-05.

1.1.3 實驗儀器

全波長酶標分析儀，美國Thermo Fisher Scientific公司，批號:THM51119300；qPCR熒光定量PCR儀，美國Thermo Fisher Scientific公司，批號:ABI7500；激光共聚焦，德國ZEISS，批號:LSM800.

1.1.4 實驗試劑配制

(1)ANIT溶液:稱取適量的ANIT，配制成5 mg/mL的ANIT橄欖油溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用.

(2)番瀉葉湯劑:取適量番瀉葉飲片，加入純水煎煮10 min，紗布過濾后濾液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濃度濃縮至1 g/mL生藥，4℃?zhèn)溆?

(3)甲嘎松湯:干姜、豆蔻和肉豆蔻打粉，過6號篩(100目)，按干姜:豆蔻:肉豆蔻=6∶5∶4的重量比混勻，配制成0.66 g/kg(0.066 g/mL)的混懸液，煮沸10 min，臨用前混勻.

(4)茵陳術(shù)附湯煎劑:以3∶6∶1.5∶1.5∶3∶1的比例將茵陳、白術(shù)、附子、干姜、炙甘草，肉桂備用，附子先煎60 min，其余藥后下煎煮30 min，紗布過濾后濾液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濃度濃縮至1 g/mL.

1.2 實驗方法

1.2.1 寒性肝病模型的建立及藥物組給藥

小鼠隨機分為5組，分別為正常組，慢性黃疸模型組，寒性肝病模型組，茵陳術(shù)附湯陽性組(10 g/kg)，甲嘎松湯組(0.66 g/kg).模型及各藥物組隔日早上皮下注射ANIT橄欖油(50 mg/kg)，每天上午寒性肝病模型組、茵陳術(shù)附湯組、甲嘎松湯組灌胃番瀉葉湯劑，慢性黃疸模型組給予等量生理鹽水，藥物組每天下午灌胃對應(yīng)藥物.正常組給予等量生理鹽水.ANIT造模14天后取材.

1.2.2 樣本采集與實驗方法

小鼠眼眶取血后，靜置分離血清，檢測血清中ALT、AST、AKP及TBA含量；取肝最大葉肝尖部位的組織和回腸組織，進行HE染色和Masson染色，并在顯微鏡下觀察其病理形態(tài)改變；通過免疫熒光共定位觀察肝組織中P-Smad2/3的入核情況；取部分肝組織用qPCR熒光定量的方法檢測肝臟中FXR、MRP2、NTCP、MMP2、MMP13、TIMP1的轉(zhuǎn)錄水平和采用Elisa法測定TGF-β1的含量；取部分回腸組織，通過免疫熒光共定位的方法檢測ZO-1和Occludin的陽性表達；將剩余的小腸組織制備10%的腸勻漿，檢測GSH、GSSG和MDA含量、HO-1、NQO1、FXR、IL-10 mRNA的水平和采用Elisa法測定IL-1β的含量；此外，使用LC-MS進行定量檢測血清中膽汁酸的成分和含量.

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

對數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗(Kolmogorov-Smirnov test)及方差齊性檢驗(Bartlett′s test)后，對于符合正態(tài)分布，方差齊的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，組間比較使用多重T檢驗(Tukey′s).對于不符合正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)，使用使用Dunnett’s T3檢驗.P值小于0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)差異.使用GraphPad Prism 8.0作圖.

2 實驗結(jié)果

2.1甲嘎松湯對寒性肝病模型動物肝損傷的作用

2.1.1對肝臟功能指標的調(diào)控

如圖1，與正常組相比，慢性黃疸模型與藏醫(yī)寒性肝病模型的肝功酶ALT、AST、AKP、TBA均顯著升高，但兩者沒有明顯差異.茵陳術(shù)附湯和甲嘎松湯均能改善藏醫(yī)寒性肝病模型的肝功酶和血清總膽汁酸的升高.

圖1 甲嘎松湯對寒性肝病模型肝功酶的調(diào)控(Mean±SEM，n=8)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術(shù)附湯組，JGST甲嘎松湯組，**p＜0.01Fig.1 The regulation of JGST on liver function enzymes inCold-Liver disease model(Mean±SEM，n=8)

2.1.2 對肝臟病理損傷的改變

如圖2，慢性黃疸模型出現(xiàn)炎癥浸潤和膽管增生，寒性肝病模型的炎性浸潤和膽管增生顯著加重，茵陳術(shù)附湯和甲嘎松湯能夠改善寒性肝病模型的炎癥浸潤和膽管增生.

圖2 甲嘎松湯對寒性肝病模型病理損傷的改變(200×，n=6)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術(shù)附湯組，JGST甲嘎松湯組Fig.2 Effect of JGST on pathological damage of Cold Liver disease model(200×，n=6)

2.1.3 對肝臟膽汁酸蛋白的影響

如圖3所示，慢性黃疸模型及寒性肝病模型會抑制肝臟FXR及其下游蛋白MRP2、NTCP的轉(zhuǎn)錄，甲嘎松湯和茵陳術(shù)附湯能提高FXR、MRP2、NTCP的轉(zhuǎn)錄水平，提示甲嘎松湯有助于緩解肝臟膽汁酸淤積.

圖3 甲嘎松湯對寒性肝病模型肝臟膽汁酸蛋白的影響(Mean±SEM，n=8)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術(shù)附湯組，JGST甲嘎松湯組，*P＜0.05，**P＜0.01.Fig.3 Effect of JGST on bile acid protein in Cold Liver disease model(Mean±SEM，n=8)

2.1.4肝臟Masson染色的改變

寒性肝病模型與慢性黃疸模型比較，膠原沉積增多，膠原容積分數(shù)增大，甲嘎松湯與茵陳術(shù)附湯均能改善寒性肝病模型的膠原沉積，如圖4.

圖4 甲嘎松湯對寒性肝病模型Masson染色的改善(200×，n=6)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術(shù)附湯組，JGST甲嘎松湯組Fig.4 Improvement of JGST on masson of Cold Liver disease model(200×，n=6)

2.1.5 對TGF-β1/P-Smad通路的影響

如圖5所示，寒性肝病模型P-Smad2/3陽性表達顯著高于正常組和慢性黃疸模型組，甲嘎松湯和茵陳術(shù)附湯均能降低P-Smad2/3的入核，降低肝臟TGF-β1的含量，下調(diào)αsma的轉(zhuǎn)錄.

圖5 甲嘎松湯對寒性肝病模型TGF-β1/P-Smad通路的作用注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術(shù)附湯組，JGST甲嘎松湯組；P-Smad2/3，n=3，放大倍數(shù)400X；αsma、TGF-β1，n=8；*P＜0.05，**P＜0.01Fig.5 Effect of JGST on TGF-β1/P-Smad pathway in Cold Liver disease model

2.1.6 對纖維化調(diào)控因子的作用

寒性肝病模型中纖維化相關(guān)因子MMP13和TIMP1的升高，茵陳術(shù)附湯能下調(diào)MMP13、TIMP1轉(zhuǎn)錄.甲嘎松湯能降低寒性肝病模型中肝臟MMP2和MMP13的升高，但對TIMP1無明顯作用，如圖6.

圖6 甲嘎松湯對寒性肝病模型纖維化調(diào)控因子的作用(Mean±SEM，n=8)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術(shù)附湯組，JGST甲嘎松湯組，*P＜0.05，**P＜0.01Fig.6 Effect of JGST on fibrosis regulatory factors of Cold Liver disease model(Mean±SEM，n=8)

2.2 甲嘎松湯對寒性肝病模型動物腸道損傷的作用

2.2.1 腸道屏障損傷的影響

圖7，慢性黃疸模型和寒性肝病模型腸道出現(xiàn)絨毛斷裂，ZO-1和Occludin的表達下降(病變部位如黃色箭頭所示)，其中Occludin在寒性肝病模型表達比慢性黃疸模型稍低(病變部位如黃色箭頭所示).甲嘎松湯和茵陳術(shù)附湯均能改善寒性肝病模型的腸絨毛斷裂，增加ZO-1和Occludin的表達.

圖7 甲嘎松湯對寒性肝病模型腸道屏障損傷的作用注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術(shù)附湯組，JGST甲嘎松湯組；HE，n=6，放大倍數(shù)100×；ZO-1、Occludin，n=3，放大倍數(shù)400×，病變部位用黃色箭頭表示Fig.7 Effect of JGST on intestinal barrier injury in Cold Liver disease model

2.2.2 對腸道氧化損傷的影響

如圖8所示，慢性黃疸模型和寒性肝病模型的抗氧化酶GSH、NQO1、HO-1較正常組顯著下降，氧化物MDA、GSSG顯著上升，抗氧化指標GSH/GSSG顯著下降.寒性肝病模型相比慢性黃疸模型，GSSG顯著升高，GSH/GSSG顯著下降.甲嘎松湯和茵陳術(shù)附湯均能改善上述指標.

圖8 甲嘎松湯對寒性肝病模型腸道氧化損傷的作用(Mean±SEM，n=8)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術(shù)附湯組，JGST甲嘎松湯組，*P＜0.05，**P＜0.01Fig.8 Effect of JGST on Intestinal oxidative damage in Cold Liver disease model(Mean±SEM，n=8)

2.2.3 對腸道炎癥的影響

如圖9所示，慢性黃疸和寒性肝病模型上調(diào)了致炎因子IL-1β的表達，抑制了抗炎因子IL-10的轉(zhuǎn)錄.甲嘎松湯、茵陳術(shù)附湯均能降低IL-1β的表達，增強抗炎因子IL-10的轉(zhuǎn)錄.

圖9 甲嘎松湯對寒性肝病模型腸道炎癥損傷的作用(Mean±SEM，n=8)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術(shù)附湯組，JGST甲嘎松湯組，**P＜0.01Fig.9 Effect of JGST on intestinal inflammation damage in Cold Liver disease model(Mean±SEM，n=8)

2.2.4 對腸FXR的作用

如圖10，顯示慢性黃疸模型及寒性肝病模型抑制了腸FXR的轉(zhuǎn)錄，甲嘎松湯、茵陳術(shù)附湯能顯著增加腸FXR的轉(zhuǎn)錄.

圖10 甲嘎松湯對寒性肝病模型腸FXR的作用(Mean±SEM，n=8)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術(shù)附湯組，JGST甲嘎松湯組，**P＜0.01Fig.10 Effect of JGST on intestinal FXR in Cold Liver disease model(Mean±SEM，n=8)

2.3 甲嘎松湯對寒性肝病模型動物血清膽汁酸圖譜的作用

2.3.1 對血清膽汁酸的總體作用

如圖11中OPLS-DA和聚類熱圖主要表現(xiàn)膽汁酸的總體變化，顯示寒性肝病模型與慢性黃疸模型相比，血清膽汁酸成分總體具有明顯差異.甲嘎松湯給藥組與寒性肝病模型組相比，血清膽汁酸圖譜有明顯變化.

3.3.2 對血清膽汁酸差異的作用

如圖12，慢性黃疸模型組與正常組比較，抗炎作用膽汁酸ω-MCA顯著減少，毒性膽汁酸TCA，TβMCA的升高.寒性肝病模型相比慢性黃疸模型，血清中大量膽汁酸成分增加，其中毒性TCA、TLCA、TβMCA的含量較慢性黃疸模型顯著增加.甲嘎松湯給藥后，血清中各類膽汁酸均表現(xiàn)為明顯下降，其中毒性膽汁酸TLCA、DCA、LCA、TCA、TCDCA均減少.

圖11 慢性黃疸模型、寒性肝病模型與甲嘎松湯給藥組血清膽汁酸總體變化注:A為正常組與慢性黃疸模型組的OPLS-DA圖；B為慢性黃疸模型組與寒性肝病模型組OPLS-DA圖；C為肝寒模型組與甲嘎松湯給藥組OPLS-DA圖；D為寒性肝病模型和慢性黃疸模型聚類熱圖；E為甲嘎松湯給藥組與肝寒模型聚類熱圖，n=5Fig.11 Overall change of serum bile acid between chroniccholestasis，cold liver disease and JGST administration group

圖12 慢性黃疸模型、寒性肝病模型與甲嘎松湯給藥組血清膽汁酸差異注:圖A，慢性黃疸模型組與正常組相比，血清差異膽汁酸成分；圖B，寒性肝病模型組與正常組相比，血清差異膽汁酸成分；圖C，甲嘎松湯給藥后為與模型組相比，血清膽汁酸變化；n=5Fig.12 The difference of serum bile acid between chroniccholestasis，cold liver disease and JGST administration group

3 討論

藏醫(yī)理論認為，寒性肝病有食欲不振，消化功能減退，大便稀薄的特征.番瀉葉有瀉下作用，會造成大便稀薄，同時會出現(xiàn)食欲不振、消化酶減少等消化功能減退的癥狀[8].本研究擬采用番瀉葉模擬寒性肝病胃火勢微弱，消化功能減退，大便稀薄的癥狀特征，在慢性黃疸模型的基礎(chǔ)上添加番瀉葉造模.通過檢測肝功酶，觀察肝臟和腸道的病理，以及腸道上皮屏障的改變，結(jié)果顯示寒性肝病模型肝臟中堿性磷酸酶、總膽汁酸明顯升高，膽管增生明顯，提示動物出現(xiàn)了黃疸，同時肝臟出現(xiàn)膠原沉積、腸道以及腸上皮屏障的損傷更嚴重，且造模過程中實驗動物出現(xiàn)大便稀薄狀況，提示初步建立了藏醫(yī)的寒性肝病模型.

藏醫(yī)將肝病各種表現(xiàn)癥狀歸納為三種不同癥型，均呈現(xiàn)有皮膚略暗黃或暗黃癥狀.寒性肝病(“培根”癥型)的癥狀，除鞏膜和皮膚略呈暗黃外，伴有消化不良、食欲不振、大便不成形[3].從上述癥狀分析，寒性肝病以慢性黃疸以及腸道損傷為主要病變特征.根據(jù)ANIT的造模原理，其通過誘導(dǎo)膽管上皮釋放炎癥因子誘發(fā)肝臟炎癥，造成肝內(nèi)膽汁淤積[9].前期研究發(fā)現(xiàn)，多次注射ANIT制備慢性膽汁淤積模型，會出現(xiàn)膽汁酸穩(wěn)態(tài)失衡.腸道中膽汁酸含量異常有可能導(dǎo)致腸道損傷.在寒性肝病模型中，腸道緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達顯著下降，腸絨毛斷裂，致炎因子IL-1β升高，抗炎因子IL-10降低，抗氧化指標GSH/GSSG顯著下降，氧化產(chǎn)物GSSG顯著升高，提示在寒性肝病模型中，腸道出現(xiàn)明顯氧化損傷、炎癥損傷和腸屏障損傷.

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)腸肝軸理論認為，腸和肝臟的關(guān)系密切.腸和肝通過多種介質(zhì)互相聯(lián)系，其中腸道菌群代謝物和膽汁酸是聯(lián)系肝腸的兩種重要介質(zhì)[10].對于膽汁淤積作用機制的研究，主要以核受體為靶點.寒性肝病模型中腸膽汁酸受體FXR轉(zhuǎn)錄被明顯抑制，其下游的ASBT趨勢相同.而ASBT的減少，表明腸道對膽汁酸的重吸收功能減弱.在該模型中，血清膽汁酸成分較慢性模型出現(xiàn)顯著差異.ω-MCA被認為是具有抗炎作用的膽汁酸[11]，TCA和TβMCA被認為對于肝臟有毒性作用[12-13].其中TCA是艱難梭菌的強效誘發(fā)劑，提示了腸道菌群結(jié)構(gòu)的失調(diào)[14].在寒性肝病模型中血清ω-MCA的減少，TCA和TβMCA的增多提示膽汁酸的正常轉(zhuǎn)運被破壞，致使毒性膽汁酸的增多及有益膽汁酸的降低.

腸道損傷影響肝臟主要觀點是“腸漏”學(xué)說，其理論在于腸道損傷后，腸道的模式損傷相關(guān)分子(PAMPs)，進入肝門靜脈，進而影響肝臟[15]，膽汁酸是PAMPs的一種，其成分和量將通過腸肝循環(huán)影響肝臟.實驗結(jié)果提示寒性肝病模型能夠加重腸屏障的損傷，結(jié)合“腸漏”學(xué)說，提示寒性肝病模型可能是腸道的損傷加劇，腸通透性發(fā)生改變，使更多毒性膽汁酸穿過腸壁進入肝門靜脈，加重膽汁酸肝腸循環(huán)障礙，導(dǎo)致寒性肝病模型的肝纖維化進程加重.

甲嘎松湯為藏族傳統(tǒng)基礎(chǔ)處方，常單獨或聯(lián)合其他中藥用于小兒肝炎、寒性肝炎的治療.藏醫(yī)在治療肝病時，主張治肝先保胃，肝膽脾胃同調(diào)理的治療原則[3].實驗觀察到甲嘎松湯能夠改善寒性肝病模型造成的肝損傷并且調(diào)節(jié)肝臟的膽汁酸受體FXR，增加膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白MRP2和NTCP的表達，促進淤積的膽汁外排進腸道，減輕肝臟膽汁淤積.對寒性肝病模型造成的腸道氧化損傷、炎癥損傷和腸屏障損傷均有顯著的改善作用.提示甲嘎松湯能夠通過調(diào)理胃腸以改善模型動物的膽汁淤積性肝損傷，其機制可能與通過激活FXR調(diào)節(jié)腸肝軸穩(wěn)態(tài)有關(guān).

綜上所述，本研究在慢性黃疸模型基礎(chǔ)上灌胃給予番瀉葉湯劑初步建立了寒性肝病動物模型，同時甲嘎松湯能改善寒性肝病模型的腸肝軸損傷，表現(xiàn)為減輕寒性肝病模型造成的膽汁淤積，改善腸道屏障損傷及氧化炎癥損傷，降低血清中毒性膽汁酸含量，其具體作用機制有待進一步探討.