海 卓，熊顯榮，馬鴻程，閔星宇，郝振宇，張 賀，李 鍵，2

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳育種資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041；3.西南民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種能夠通過(guò)實(shí)時(shí)熒光信號(hào)積累獲得目的基因表達(dá)水平的分子檢測(cè)技術(shù).其具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，成為基因表達(dá)分析的一種重要工具.然而在檢測(cè)過(guò)程中提取的樣本RNA純度、反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA質(zhì)量以及實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中多種因素皆能影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性[1].因此，在進(jìn)行目的基因檢測(cè)時(shí)常常引入單個(gè)或多個(gè)內(nèi)參對(duì)目的基因進(jìn)行數(shù)據(jù)校準(zhǔn).

內(nèi)參基因又稱管家基因.就理論而言，同一內(nèi)參基因受環(huán)境影響較小，在任何條件下的表達(dá)模式都應(yīng)相對(duì)穩(wěn)定[2].但有研究發(fā)現(xiàn)，這些用于標(biāo)準(zhǔn)化矯正的內(nèi)參基因在不同物種、組織和細(xì)胞中的表達(dá)模式并不相同，且存在較大差異[3-5].由此可見(jiàn)，對(duì)目的基因表達(dá)水平進(jìn)行研究時(shí)，盲目選擇內(nèi)參基因可能致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果失真.因此，在檢測(cè)不同物種、組織及細(xì)胞中目的基因mRNA表達(dá)水平時(shí)，預(yù)篩選出單個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因具有重要意義.

小鼠因其繁殖能力強(qiáng)、成本低等特點(diǎn)，已被廣泛用于各種相關(guān)生物學(xué)研究.睪丸是雄性動(dòng)物精子發(fā)生及分泌雄性激素的場(chǎng)所，其發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜而精密的生理過(guò)程[6-7]，隨著對(duì)雄性小鼠生殖相關(guān)分子水平的研究逐漸增多[8]，對(duì)不同年齡小鼠睪丸組織進(jìn)行分子水平的相關(guān)研究是探究雄性生殖生理不可或缺的一部分，準(zhǔn)確篩選出該組織最佳內(nèi)參基因?qū)π坌孕∈笊逞芯烤哂兄匾淖饔?目前關(guān)于小鼠的最優(yōu)內(nèi)參基因篩選主要集中于大腦、小腸和肌肉等組織[9-10].因此，本研究以7種在小鼠不同組織中常見(jiàn)的表達(dá)穩(wěn)定的蛋白編碼基因(GAPDH、ARBP、β-actin、PPIA、SDHA、18S rRNA、HPRT1)作為候選內(nèi)參基因[9-15]，檢測(cè)在小鼠睪丸中的表達(dá)水平、構(gòu)建相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線并分析其在小鼠睪丸發(fā)育中的表達(dá)穩(wěn)定性.旨在獲得小鼠睪丸組織最適內(nèi)參基因，以期為后續(xù)雄性小鼠生殖相關(guān)研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料收集

試驗(yàn)所用昆明小鼠均來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室.分別挑選1周齡(W 1)、3周齡(W 3)、6周齡(W 6)和9周齡(W 9)健康雄鼠，頸椎脫臼處死后迅速分離睪丸組織，用無(wú)菌眼科剪剪碎組織并分別置于RNase-free的1.5 mL EP管中備用.其中各周齡分別采集3只雄鼠睪丸，共計(jì)12個(gè)樣本.

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

根據(jù)Trizol法提取各睪丸樣本總RNA，用核酸分析儀檢測(cè)總RNA濃度和純度，用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)總RNA進(jìn)行檢測(cè).最終選取OD260/280值在1.8～2.0之間且電泳出現(xiàn)2條完整條帶(18S和28S)的RNA樣本作為反轉(zhuǎn)錄模板，并根據(jù)TaKaRa公司的Prime-ScrptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明選取1μg總RNA為模板獲得cDNA，并將OD260/280值在1.8～2.0之間的樣本置于-20℃保存.

1.3 引物設(shè)計(jì)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

本試驗(yàn)選取GAPDH、ARBP、β-actin、PPIA、SDHA、18S rRNA和HPRT1的蛋白編碼基因作為候選內(nèi)參基因，依據(jù)NCBI在線系統(tǒng)中小鼠各基因編碼區(qū)(CDS區(qū))序列，并采用Primer5.0設(shè)計(jì)候選基因的熒光定量引物，最后送由金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行合成(表1).將1.2中反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板按照10倍稀釋法獲得5個(gè)濃度梯度cDNA進(jìn)行qPCR反應(yīng).反應(yīng)體系為15μL，包括ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 7.5μL，上、下游引物各0.5μL，cDNA 1μL，ddH2O 5.5 μL.反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性(3 min)；94℃變性(15 s)，60℃退火(30 s)，72℃延伸(35 s)，39個(gè)循環(huán)；并設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)組以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線.

表1 候選內(nèi)參基因引物序列Table 1 Sequences of primers of selected reference genes

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各引物特異性

以小鼠睪丸組織cDNA(10μmol/L)作為模板，反應(yīng)體系及程序如1.3中的介紹，且每個(gè)檢測(cè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)組.

1.5 內(nèi)參基因RT-qPCR數(shù)據(jù)處理及穩(wěn)定性分析

將候選內(nèi)參基因RT-qPCR的3組重復(fù)循環(huán)閾值(Ct值)進(jìn)行處理，分別減去最小Ct值，獲得△Ct值，進(jìn)一步利用2-△△Ct法計(jì)算出各基因在睪丸組織中的相對(duì)表達(dá)量.輸入GeNorm程序中，通過(guò)對(duì)某一內(nèi)參與其他內(nèi)參表達(dá)水平兩兩比值進(jìn)行對(duì)數(shù)變換，得出平均標(biāo)準(zhǔn)差作為候選基因在各個(gè)時(shí)期表達(dá)水平穩(wěn)定度的平均M值.其中M值越小，表示該候選內(nèi)參基因的表達(dá)越穩(wěn)定，以此篩選出小鼠睪丸中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因.

2 結(jié)果與分析

2.1 睪丸總RNA質(zhì)量分析

對(duì)所得睪丸總RNA進(jìn)行完整性檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖1)，所獲得的RNA均出現(xiàn)兩條清晰條帶(18S和28S)，且無(wú)明顯彌散的現(xiàn)象，所以沒(méi)有出現(xiàn)RNA降解，獲得的RNA完整性良好.利用核酸濃度測(cè)定儀分析各樣本OD260/280值均在1.8～2.0之間，表明提取的總RNA純度較高.

圖1 睪丸組織RNA的電泳結(jié)果編號(hào)1～4分別為出生后1周、3周、6周和9周小鼠睪丸Fig.1 Electrophoresis of testicular RNA The numbers of 1～4 were represented the testes of mice at 1 week，3 weeks，6 weeks and 9 weeks after birth

2.2 候選基因引物特異性檢測(cè)

對(duì)設(shè)計(jì)的7個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè).結(jié)果顯示各引物皆出現(xiàn)清晰、單一條帶，無(wú)引物二聚體及雜帶(圖2).同時(shí)結(jié)合Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST進(jìn)行比對(duì)，確定設(shè)計(jì)各個(gè)內(nèi)參基因引物的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)期的相同.隨后對(duì)各個(gè)基因進(jìn)行熔解曲線分析(圖3)，每個(gè)內(nèi)參基因的3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)組溶解曲線皆出現(xiàn)單一信號(hào)峰且重合度極高，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的侯選基因引物在小鼠睪丸組織中均能特異性表達(dá)，可見(jiàn)各內(nèi)參基因熒光定量分析引物特異性較好.

2.3 內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

構(gòu)建GAPDH、ARBP、β-actin、PPIA、SDHA、18S rRNA和HPRT1標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4，7個(gè)基因?qū)?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線以循環(huán)閾值(Ct值)為縱坐標(biāo)，將以10為底數(shù)的拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，由圖所示實(shí)驗(yàn)樣平均Ct值皆＜30.5.且7個(gè)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)(R2)皆＞0.993，擴(kuò)增效率都處于87.2%～104.1%之間(表2).因此，各個(gè)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好線性關(guān)系，滿足RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增要求.

2.4 內(nèi)參基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)穩(wěn)定性分析

使用GeNorm程序?qū)⒛骋粋€(gè)內(nèi)參基因與其他選擇的內(nèi)參基因表達(dá)水平的兩兩比值經(jīng)對(duì)數(shù)變換，然后計(jì)算出的平均標(biāo)準(zhǔn)差作為基因表達(dá)穩(wěn)定性的平均值(M值).本研究所選7個(gè)管家基因PPIA、β-actin、ARBP、HPRT1、SDHA、18S rRNA和GAPDH對(duì)應(yīng)的M值分別為0.513、0.513、0.804、1.154、3.179、4.481、5.021，表達(dá)穩(wěn)定性順序?yàn)镻PIA=β-actin＞ARBP＞HPRT1＞SDHA＞18S rRNA＞GAPDH.如圖所示，7種候選內(nèi)參基因最穩(wěn)定的是PPIA和β-actin，最不穩(wěn)定的為GAPDH(圖5).

圖2 內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增結(jié)果M.DL2000 DNA Marker；標(biāo)號(hào)1～7分別為β-actin、GAPDH、18S rRNA、PPIA、ARBP、SDHA和HPRT1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，不同數(shù)字代表產(chǎn)物條帶大小Fig.2 PCR result of reference genes M.DL2000 DNA Marker；The numbers of 1～7 were represented the gene PCR amplification product of β-actin、GAPDH、18S rRNA、PPIA、ARBP、SDHA and HPRT1，and different numbers represent the product band size

圖3 小鼠睪丸組織中7個(gè)內(nèi)參基因RT-qPCR溶解曲線1.GAPDH；B.ARBP；C.β-actin；D.PPIA；E.SDHA；F.18S rRNA；G.HPRT1Fig.3 RT-qPCRmelting curves of 7 reference genes in testicles

圖4 7個(gè)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curves of 7 reference genes

表2 小鼠睪丸組織7個(gè)候選內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)Table 2 Standard curves of 7 candidate reference genes of mouse testicles

圖5 內(nèi)參基因平均表達(dá)穩(wěn)定性Fig.5 The average expression stability values of reference genes

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用RT-qPCR技術(shù)并結(jié)合GeNorm程序研究小鼠睪丸組織基因穩(wěn)定表達(dá)的最佳內(nèi)參基因，在7個(gè)候選基因中PPIA是表達(dá)最穩(wěn)定管家基因之一.PPIA又稱親環(huán)素A(CypA)，是一種環(huán)孢素A(CsA)受體[11].已有研究表明，在小鼠出生后3周創(chuàng)傷性損傷的大腦皮質(zhì)中PPIA是最佳內(nèi)參基因[5].通過(guò)對(duì)感染甲型流感病毒(IAV)H1N1的小鼠肺細(xì)胞中多種管家基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PPIA亦是感染H1N1肺細(xì)胞的最佳管家基因之一[12].此外，GRIESSL M等人[13]通過(guò)將小鼠多種組織細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)后接種巨細(xì)胞病毒分析各組織管家基因表達(dá)情況得出PPIA同樣能夠在接種細(xì)胞病毒后的各組織中穩(wěn)定表達(dá)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.PPIA也最適用于人骨骼肌、免疫系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相關(guān)基因分析[14-15].且在人的正常卵巢，癌卵巢和多囊卵巢以及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中PPIA亦是最佳內(nèi)參基因[16-17].其次，有研究發(fā)現(xiàn)PPIA在禽類動(dòng)物中的大腦、垂體和性腺發(fā)育過(guò)程中表達(dá)高度穩(wěn)定[18].以上結(jié)果與本研究對(duì)小鼠睪丸組織中內(nèi)參基因篩選的結(jié)果皆一致.在對(duì)大鼠進(jìn)行不同濃度硒元素喂食后研究其不同組織中最適內(nèi)參基因發(fā)現(xiàn)，在大鼠睪丸組織中PPIA卻是一種穩(wěn)定性最低的內(nèi)參基因[19]，這可能是由于本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為小鼠，與大鼠在生物分類中的種屬不同，所以致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同.但PPIA在雌性小鼠生殖相關(guān)的組織中表達(dá)穩(wěn)定性有待進(jìn)行后續(xù)探究.

β-actin廣泛存在于生物的各種組織及細(xì)胞中，同時(shí)參與細(xì)胞骨架的維持、細(xì)胞遷移及分裂增殖等過(guò)程[20-21].因此在分析基因表達(dá)水平時(shí)，該基因是使用最為廣泛的內(nèi)參之一.有研究報(bào)道，在小鼠N2a缺氧后再注后的損傷細(xì)胞中β-actin表達(dá)穩(wěn)定性最強(qiáng)[22].這與本實(shí)驗(yàn)中對(duì)小鼠睪丸最佳內(nèi)參基因篩選結(jié)果一致.且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)β-actin亦是雌性小鼠不同時(shí)期卵巢中相對(duì)穩(wěn)定的管家基因[23].但在小鼠C3H10T1/2間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化的過(guò)程中對(duì)特定的部分基因表達(dá)進(jìn)行分析，β-actin被歸為最不適合的內(nèi)參基因之一[24].且在喂食不同濃度硒元素的大鼠睪丸中該內(nèi)參基因并不是最適參考基因[19].除了對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行研究外，ZINZOWK W M[18]等人通過(guò)對(duì)禽類動(dòng)物的多處組織進(jìn)行熒光定量分析發(fā)現(xiàn)β-actin亦不能作為最佳內(nèi)參基因.因此，更加證實(shí)篩選出不同物種的不同組織及細(xì)胞最適內(nèi)參基因尤為重要，針對(duì)后續(xù)分子檢測(cè)試驗(yàn)具有指導(dǎo)性作用.

最后，本研究結(jié)果顯示GAPDH在小鼠睪丸中表達(dá)穩(wěn)定性最差(M值=5.021).GAPDH是一種參與生物體轉(zhuǎn)錄翻譯出內(nèi)糖代謝過(guò)程中的調(diào)控因子.在各組織及細(xì)胞中GAPDH與β-actin同為常用的管家基因，因此關(guān)于小鼠生殖相關(guān)的組織及細(xì)胞中GAPDH基因穩(wěn)定性分析有一些報(bào)道[23，25].楊顯英等人[23]對(duì)雌性小鼠卵巢中穩(wěn)定基因進(jìn)行篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，GAPDH在小鼠不同發(fā)育時(shí)期卵巢組織中表達(dá)最為穩(wěn)定.FILATOV等人[25]發(fā)現(xiàn)小鼠GV期卵母細(xì)胞中多個(gè)候選內(nèi)參基因中GAPDH亦或是最適內(nèi)參基因.在小鼠巨細(xì)胞病毒感染過(guò)程中GAPDH是體外感染研究中最穩(wěn)定的參考基因[13].且通過(guò)對(duì)在小鼠小腸上皮細(xì)胞急性分析發(fā)現(xiàn)GAPDH和PPIA皆為其最適內(nèi)參基因[9].但本研究結(jié)果表明，GAPDH并不適合于小鼠不同時(shí)期睪丸相關(guān)的研究實(shí)驗(yàn)，因此不建議作為分析目的基因表達(dá)水平的最佳內(nèi)參使用.且在小鼠結(jié)腸中GAPDH的表達(dá)也不穩(wěn)定，不能作為最優(yōu)內(nèi)參基因[26].在對(duì)不同日齡的雄性胎鼠睪丸中最適內(nèi)參基因的篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GAPDH作為最適內(nèi)參基因之一用于后續(xù)研究，該結(jié)果與本研究結(jié)果不同可能是由于基因的表達(dá)具有時(shí)序性，因此，與成年小鼠睪丸中最適內(nèi)參基因存在差異受年齡影響[27].由此可見(jiàn)，對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)間段的雄性小鼠生殖進(jìn)行深入研究之前，確定1個(gè)或多個(gè)相對(duì)表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因在一定程度上能夠提高檢測(cè)的相關(guān)目的基因表達(dá)水平準(zhǔn)確性以及可信度.

4 結(jié)論

本研究結(jié)合RT-qPCR技術(shù)分析小鼠中7個(gè)常見(jiàn)候選內(nèi)參基因在睪丸發(fā)育過(guò)程中表達(dá)穩(wěn)定性，其中PPIA和β-actin為小鼠睪丸發(fā)育過(guò)程中最適內(nèi)參基因，GAPDH表達(dá)最不穩(wěn)定.因此，PPIA和β-actin為可作為出生后小鼠睪丸發(fā)育過(guò)程中最適內(nèi)參基因，為進(jìn)一步準(zhǔn)確分析小鼠睪丸組織中目的基因的表達(dá)模式提供可靠的依據(jù).